協(xié)同生物
非酒精脂肪性肝炎（NASH）是一種無過量飲酒，以肝臟細胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉炎癥為主要臨床病理特征的綜合征。它是非酒精脂肪性肝?。∟AFLD）發(fā)展為肝硬化和肝癌的一個重要階段。據(jù)報道NAFLD在發(fā)達國家的發(fā)病率表現(xiàn)為成人30%、兒童13%，其中大約有10%的NAFLD患者發(fā)展成為NASH，而NASH患者中的10%會發(fā)展成為肝硬化，甚至肝癌。
非酒精脂肪性肝炎已經(jīng)成為研究的焦點，然而NASH的發(fā)病機制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)其與胰島素抵抗、氧化應激、瘦素、Kupffer細胞等多種因素相關。目前臨床上的藥物普遍存在毒副作用較大、價格昂貴等問題，而被證實的有效且無副作用治療方法僅有適當?shù)臐u進性減肥運動這一項。 因此探索新型無毒副作用藥物對其NASH臨床治療具有重要意義，而可靠的動物模型對探索NASH的發(fā)病機制及防治發(fā)揮著關鍵性作用。
目前國內(nèi)外的NASH模型主要包括3類：
① 營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型，它包括了高脂飲食脂肪肝動物模型、高糖飲食脂肪肝動物模型和蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）脂肪肝動物模型。
② 復合因素誘導的NASH模型，主要是以高脂肪飼料加化學藥物來進行造模，包括四氯化碳脂肪肝動物模型、四環(huán)素脂肪肝動物模型、乙硫氨酸脂肪肝動物模型。
③ 特殊品系脂肪肝動物模型，主要有瘦素缺乏和抵抗小鼠模型、PTEN基因敲除小鼠模型。其中，MCD飼料誘導的NASH模型是目前國際上被廣泛認可的模型。
該模型最早由Shinozuka提出，起初是用于探討飲食因素對肝臟腫瘤形成的影響，后來發(fā)現(xiàn)在短期內(nèi)可以引起脂肪性肝炎。該模型的脂肪性肝炎發(fā)展速度快，其病理病變與人類的NASH類似，因此成為近年來國內(nèi)外學者研究NASH的熱點模型，但未見關于在大小鼠體內(nèi)用MCD飼料誘導NASH模型差異比較的報道。
本研究旨在通過MCD飼料分別建立大、小鼠NASH模型，比較其生化和病理指標，探討兩種動物模型的差異，為NASH的基礎研究和防治藥物的開發(fā)提供可靠的動物模型。
實驗動物與方案
實驗動物
SPF級C57BL/6雄性小鼠18只，8~9周齡，體重為22~25 g；SPF級SD雄性大鼠18只，8~9周齡，體重為300~350g。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學院實驗動物中心，屏障環(huán)境動物房室溫（22 ±1）° ，相對濕度30%~60%，12h光照/12h黑暗，動物自由采食和飲水。
實驗試劑
檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）含量的試劑盒，均購自德國羅氏診斷公司，按說明書和文獻報道的方法進行檢測。
動物飼料
蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料和蛋氨酸膽堿充足（MCS）飼料，根據(jù)飼料生產(chǎn)公司技術人員的指導進行飼養(yǎng)。
動物分組
將18只C57BL/6小鼠和18只SD大鼠分別隨機分成正常組（飼喂MCS飼料）和模型組（飼喂MCD飼料）。模型組需要1周過渡性飼料的喂養(yǎng)，第1 ~3天將MCS和 MCD飼料按2:1混合后喂養(yǎng)，第4 ~5天按1:1混合喂養(yǎng)，第6-7天按1:2混合喂養(yǎng)，1周后完全投喂MCD飼料。過渡性飼養(yǎng)后的第3、5、8周在各組中分別隨機選取6只動物樣本，進行肝功能生化指標和肝臟病理的檢測。從過渡飼喂開始且每周稱量動物體質(zhì)量（g）并記錄。
實驗結果
體質(zhì)量變化
正常對照組實驗動物的體質(zhì)量持續(xù)增長，模型組實驗動物體質(zhì)量逐漸減輕；從第 3周開始，相比于正常組，模型組的實驗動物體質(zhì)量都顯著降低。
動物血清中ALT、AST、TC和TG的含量
從第3周開始，模型組小鼠肝酶AST和ALT水平與正常組相比，均已顯著升高。相比之下，大鼠模型組在檢測的3個時間點，肝酶AST水平無顯著變化，而ALT水平從第3周開始顯著升高。在檢測的造模后第3周、5周、8 周，大、小鼠血清中TG和TC含量均顯著降低。
肝組織HE染色
正常對照組肝小葉結構清晰、完整，肝細胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排 列,無肝細胞氣球樣變或炎癥細胞浸潤（見圖1A、C）。MCD飼料飼喂8周后，模型組的大鼠肝組織小葉結構已被破壞，大泡性氣球樣變細胞占了總細胞的2/3以上，以肝小葉周邊脂肪變性最為嚴重， 局部可見大泡性氣球樣變和以單個核細胞浸潤為主炎癥反應（見圖1B）。8周時模型組小鼠肝組織光鏡下見肝小葉結構紊亂，細胞出現(xiàn)嚴重的脂肪變 性，中央靜脈周圍出現(xiàn)嚴重、以浸潤為主的局灶壞 死性炎癥（見圖1D）。具體NAFLD活動度積分見表3，SD大鼠和C57BL/6小鼠綜合評分均表現(xiàn)為模型組與正常組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0. 05）。
實驗討論
MCD飼料誘導的NASH模型的主要發(fā)病機制是由于飼料缺乏膽堿而引起機體卵磷脂合成不足。蛋氨酸為合成載脂蛋白所必需的氨基酸，缺乏 酸會導致低密度脂蛋白膽固醇合成減少，因此無法 將三酰甘油運出肝外而累積形成脂肪肝。另一方面，缺乏膽堿還會引起肝臟線粒體內(nèi)部活性氧增加，最終導致氧應激增加而肝臟發(fā)生損傷。氧應激不但導致細胞多種功能和結構損傷，而且活化TNFα及其他促炎癥細胞因子。
該模型自1978年Shinozuka提出以來，被國內(nèi)外的學者廣泛應用于藥物篩選，但是缺少文獻對該模型在C57BL/6小鼠和SD大鼠的系統(tǒng)性報道。于是本實驗飼喂MCD飼料建立大、小鼠NASH模型，對其血液的生化指標和肝臟的病理指標進行了比較，旨在探討兩種動物模型的生化和病理差異，以選擇理想的動物模型。
本研究的結果顯示，在肝損傷指數(shù)方面，飼喂MCD飼料的第3周開始，模型組小鼠的肝酶AST、 ALT水平與正常組相比已經(jīng)顯著升高，但模型大鼠 AST水平從實驗開始至結束仍無顯著差異，而AST和ALT的水平在臨床研究中通常作為肝臟功能評價重要指標，反映脂肪肝的早期損害，因此表明C57BL/6小鼠對MCD飼料的反應在早期比SD大鼠更敏感 ，更容易引起肝損傷肝 。
而且肝組織病理結果顯示，飼喂MCD飼料8周，模型組小鼠肝組織比大鼠出現(xiàn)的脂肪變性更嚴重，小區(qū)域出現(xiàn)小泡為主的細胞氣球樣變及輕微的炎癥反應；同時通過肝組織病例評分結果表明8周后模型組小鼠肝組織炎癥反應及脂肪變性等病理特征的得分明顯高于大鼠。另外，小鼠具有采食量少、成本低及操作方便等優(yōu)點。因此，綜合生化指標及病理特征等因素，MCD飼料誘導的C57BL/6小鼠模型比SD大鼠模型更適用于進一步研究NASH.
本文作者：崔國禎/余漢濠/黃天養(yǎng)/王文/徐義祥/程自剛/吳彩燕/李銘源，遵義醫(yī)學院
