高膽固醇飼料建立小鼠膽結(jié)石模型的研究

譯者導(dǎo)讀：這是一篇關(guān)于構(gòu)建小鼠膽結(jié)石疾病模型以研究人類膽結(jié)石形成機(jī)制的文章，該文論述了小鼠膽結(jié)石模型建立的研究歷程，指出了人類膽結(jié)石形成機(jī)制的新思路。

重點(diǎn)是，文章總結(jié)了諸多研究的過程與結(jié)果，這些研究通過結(jié)合基因組學(xué)方法和小鼠表型研究成功鑒定了Lith基因，為人類Lith基因的發(fā)現(xiàn)推平道路。用基因敲除或轉(zhuǎn)基因方法為膽結(jié)石這種“古老而又新鮮”的肝膽疾病的病理生理學(xué)研究提供了新的視角。對于從事膽結(jié)石課題研究、動(dòng)物模型建立、高膽固醇飼料制備等工作的研究者來說，此文值得一讀。

作者：Tony Y. Wang、Piero Portincasa等

譯者：協(xié)同生物蘇永騰博士

前言

膽結(jié)石是最常見的肝膽疾病之一，12%美國成年人深受其害，為減少膽結(jié)石的發(fā)病率、死亡率，深入研究膽結(jié)石的病理生理學(xué)將有助于開發(fā)出創(chuàng)新有效的治療方法。

從20世紀(jì)50年代開始，研究者就通過給倉鼠、老鼠、豚鼠、兔子和猴子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)數(shù)周到幾個(gè)月的高膽固醇飼料并成功建立了膽結(jié)石模型，從而根據(jù)模型研究膽結(jié)石疾病的發(fā)病機(jī)制。直至上世紀(jì)90年代，第一個(gè)與膽結(jié)石相關(guān)的基因-Lith1在近交系C57L/J小鼠中得以鑒定。

我們通過此文介紹小鼠膽結(jié)石模型的建立、模型對遺傳研究以及膽結(jié)石病理生理學(xué)研究的貢獻(xiàn)，為膽結(jié)石研究做一個(gè)概覽綜述。

小鼠膽結(jié)石模型的建立

Tepperman等研究者率先發(fā)現(xiàn)可以通過膽固醇和膽酸的組合使用來建立小鼠膽結(jié)石模型。在喂養(yǎng)含有膽固醇和膽酸的飼料后，發(fā)現(xiàn)從小鼠膽石中提取出來的甾醇基本上是膽固醇，占了結(jié)石總重量的94%，而單獨(dú)喂養(yǎng)1%膽固醇飼料2-8個(gè)月卻不能誘發(fā)出膽結(jié)石。由此可見，膽酸在小鼠膽結(jié)石模型建立中必不可少。

1978年，F(xiàn)ujihira等研究者給七種近交系小鼠飼喂高膽固醇飼料8周后觀察到小鼠出現(xiàn)膽結(jié)石，患病率從0%到100%不等。Alexander和Portman等人的研究進(jìn)一步確認(rèn)了小鼠在高膽固醇飼料的喂養(yǎng)下，膽結(jié)石患病率存在品系差異，這些研究分析為小鼠膽結(jié)石病基因研究打下了良好基礎(chǔ)。

更重要的是，Wang等人發(fā)現(xiàn)小鼠喂養(yǎng)高膽固醇飼料8周內(nèi)膽固醇結(jié)晶和膽結(jié)石形成的具體過程，先是粘蛋白凝膠的初始積累，繼而出現(xiàn)無水或液晶狀外觀，然后這些膽固醇晶體聚集，最后出現(xiàn)砂質(zhì)結(jié)石和真膽結(jié)石（見下圖）。

膽結(jié)石易感小鼠C57L/J飼喂高膽固醇飼料8周內(nèi)膽固醇結(jié)晶和膽結(jié)石形成的顯微照片（用相襯法，偏光顯微鏡）

（a）粘蛋白凝膠；（b）小液晶；（c）聚集液晶；（d）具有麥芽交叉雙折射和焦點(diǎn)圓錐結(jié)構(gòu)的熔融液晶；（e）弧形（可能是無水膽固醇）晶體；（f）絲狀晶體；（g）端部管狀晶體破裂產(chǎn)生膽固醇一水合物晶體；（h）典型的膽固醇一水合物晶體，從28和100.88的角度；（i）聚集的膽固醇一水合物晶體；（j和k）砂質(zhì)結(jié)石；（l）膽結(jié)石。

小鼠模型對膽結(jié)石遺傳學(xué)研究的貢獻(xiàn)

流行病學(xué)和臨床調(diào)查（如對不同家庭和雙胞胎的相關(guān)調(diào)查）研究已很清楚地表明了遺傳基礎(chǔ)在個(gè)體患膽結(jié)石病方面發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。然而，人們還沒有全部掌握遺傳因素對膽結(jié)石的影響，因?yàn)槟懡Y(jié)石是由多種環(huán)境因素以及未知基因相互作用和復(fù)雜調(diào)控引起的。

此外，為了定量研究多基因性狀，常規(guī)單基因性狀遺傳作圖法不適用于膽結(jié)石研究。近交系老鼠有著優(yōu)良的遺傳資源，是研究膽結(jié)石遺傳學(xué)的優(yōu)選動(dòng)物模型。Khanuja等人在給實(shí)驗(yàn)小鼠飼喂高膽固醇飼料12周后，率先發(fā)現(xiàn)了膽結(jié)石易感鼠C57L/J和抗膽結(jié)石鼠AKR/J之間成石的差異是由兩個(gè)Lith基因決定——Lith1和Lith2.

隨后，C57L/J和AKR/J小鼠的肝、膽囊、小腸等部位都被用來進(jìn)行了系統(tǒng)的基因表型對比研究。為了判斷Lith1和Lith2兩個(gè)基因中哪個(gè)單獨(dú)誘導(dǎo)膽結(jié)石的產(chǎn)生，攜帶Lith1的C57L/J小鼠（膽結(jié)石易感）或Lith2等位基因的AKR/J小鼠（抗膽結(jié)石）模型被建立并進(jìn)行致石研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lith1和Lith2通過不同的成石機(jī)制誘導(dǎo)膽結(jié)石的發(fā)生，Lith1調(diào)控膽固醇的代謝，Lith2則與膽汁酸分泌密切相關(guān)。

研究者通過更多的近交系小鼠膽結(jié)石模型研究發(fā)現(xiàn)，還有更多Lith基因參與膽結(jié)石的成石調(diào)控，Lith基因家族Lith1～Lith25在染色體上的分布如下圖所示。

膽結(jié)石（Lith）基因圖譜

一條垂直線代表一條染色體，著絲粒在頂端。距著絲粒（水平黑線）的遺傳距離顯示在染色體的左側(cè)。膽結(jié)石QTL（Lith基因）和候選基因的位置用水平黑線表示，基因符號(hào)在右邊（基因符號(hào)和名稱略）。

因?yàn)槿祟惡托∈笕旧w同源的原因，以上這些來自小鼠的基因研究對人類的Lith基因的發(fā)現(xiàn)有著指導(dǎo)性的作用，并成功證實(shí)了人類的LITH基因ABCG5/G8。

研究者先是在小鼠身上發(fā)現(xiàn)和鑒定了ABCG5/G8基因，隨后在德國人和智利人身上發(fā)現(xiàn)ABCG5/G8的兩個(gè)相關(guān)變體（即ABCG5-R50C和ABCG8-D19H），之后又在中國人和印度人身上得以印證。

因此，根據(jù)小鼠的Lith基因圖譜，人類的更多Lith基因及其致病性機(jī)制將得以發(fā)現(xiàn)和闡明。2010年，研究者首次提出了膽結(jié)石病的五種發(fā)病因素（見下圖）：遺傳因素和Lith基因；肝膽固醇高分泌，導(dǎo)致膽固醇過飽（即高膽固醇飽和指數(shù)）；膽固醇結(jié)晶和固體膽固醇晶體的生長；膽囊運(yùn)動(dòng)受損；腸道因素，包括吸收的膽固醇從小腸輸送到肝臟引起膽汁高分泌，以及腸道微生物群的變化。

五種因素的相互作用示意圖：（i）遺傳因素和Lith基因；（ii）肝臟高分泌；（iii）膽囊動(dòng)力低下；（iv）快速相變以及（v）腸道因素。持續(xù)性肝膽固醇高分泌是遺傳因素調(diào)控的結(jié)果，導(dǎo)致膽固醇過飽和膽汁的形成，加速膽固醇結(jié)晶。膽囊運(yùn)動(dòng)功能受損可導(dǎo)致多余粘蛋白凝膠的產(chǎn)生和積累，促進(jìn)膽泥的形成和微小結(jié)石的生長。這些改變也破壞了膽汁酸（腸道因素）的肝腸循環(huán)動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致腸道吸收和膽汁酸池的變化。膽固醇吸收的增加將過量膽固醇輸送到肝臟，分泌到膽汁中。腸道微生物群的異?？赡軙?huì)破壞肝臟、腸道和膽汁中膽固醇和膽汁酸的代謝，并損害膽囊的排空和再灌注。

可見，膽固醇晶體的快速生長、聚集形成微小結(jié)石、最終成石這一結(jié)果都是由于膽固醇過飽和導(dǎo)致的，還有就是膽囊粘液的高分泌以及膽囊受損的凝膠形成，最終導(dǎo)致了膽泥（即膽結(jié)石的前體物）的形成。

膽結(jié)石病理生理學(xué)研究最新進(jìn)展

研究發(fā)現(xiàn)女性膽結(jié)石患病率明顯較高于同年齡段的男性，這意味著雌激素在膽結(jié)石的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵性的影響。盡管雌激素受體a（ERa）能通過調(diào)控雌二醇（E2）的形成來誘導(dǎo)雌性小鼠膽結(jié)石的發(fā)生，但E2對小鼠的致石機(jī)理尚不明確。

一些研究發(fā)現(xiàn)，ERa基因敲除小鼠大劑量E2處理后仍發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石。此外，有人發(fā)現(xiàn)名為Lith18G的一種膽結(jié)石基因同時(shí)也是一種雌激素受體——G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）。這一發(fā)現(xiàn)帶來了一個(gè)新問題，E2是如何通過有效綁定并激活GPR30和ERa來影響膽結(jié)石的形成呢？

為了區(qū)分ERa和GPR30的致石作用，需要對整個(gè)膽固醇的結(jié)晶路徑和順序去探究。通過雌性野生型卵巢切除、GPR30敲除、ERa敲除和GPR30/ERa雙基因敲除等方法進(jìn)行分析研究。E2分別與GPR30以及ERa結(jié)合后，激活了液晶和無水晶體的產(chǎn)生，使得膽汁從過飽和狀態(tài)進(jìn)化到中間體結(jié)晶物。

此外，在GPR30/ERa-DKO小鼠模型中，膽固醇的結(jié)晶明顯受阻。這表明GPR30與ERa在促進(jìn)E2誘導(dǎo)的膽結(jié)石發(fā)生中具有協(xié)同作用。由于GPR30主要存在于肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而不是細(xì)胞核內(nèi)，其可能是通過表皮生長因子受體信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑抑制肝臟膽固醇7a羥化酶和膽汁酸的合成，導(dǎo)致肝臟過量分泌膽固醇并成石。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是膽結(jié)石形成的一個(gè)重要影響因素，NAFLD與膽結(jié)石之間的聯(lián)系機(jī)制仍不清楚。缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF1）是調(diào)節(jié)氧傳遞、細(xì)胞生長和氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)機(jī)體對缺氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)。

HIF1A主要存在于肝臟的周圍靜脈，即生理性缺氧的區(qū)域中。肝臟脂肪變性時(shí)，脂質(zhì)的積累使肝細(xì)胞的體積明顯增大，循環(huán)減少而最終導(dǎo)致缺氧。Asai等研究發(fā)現(xiàn)，在HIF1A基因敲除小鼠中，一種負(fù)責(zé)將肝臟分泌液分泌到膽管的水通道蛋白-8（AQP-8）的表達(dá)顯著增加。這些變化使膽汁流量顯著增加35%，膽囊和肝臟膽汁中的膽汁脂質(zhì)濃度降低36%，并減輕了膽囊的炎癥。

結(jié)果，肝臟特異性HIF1A基因敲除小鼠的膽固醇結(jié)晶被抑制，膽結(jié)石的形成也被阻止。相反，在飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性中，由于HIF1A通路的激活，野生型小鼠肝臟加速了膽結(jié)石的形成。此外，在伴有膽結(jié)石的NAFLD患者肝臟中HIF1A及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)增加，這種結(jié)果提示了HIF1A在NAFLD患者的膽結(jié)石中發(fā)揮了重要影響。膽汁的流動(dòng)是由膽汁酸依賴性和非膽汁酸依賴性兩種途徑?jīng)Q定，水和離子/非離子溶質(zhì)通過跨細(xì)胞和細(xì)胞旁途徑經(jīng)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)促使了膽汁的形成。

Cludin 2（Cldn2）是一種細(xì)胞旁通道形成蛋白，在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中高度表達(dá)。Matsumoto研究發(fā)現(xiàn)Cldn2基因敲除小鼠的膽汁流速與野生型小鼠相比降低了50%，這是由于肝膽系統(tǒng)的水滲透性降低所致，從而顯著增加膽汁中的總脂質(zhì)濃度。4周后，Cldn2基因敲除小鼠產(chǎn)生了膽結(jié)石，而野生型小鼠并沒有出現(xiàn)結(jié)石，這表明Cldn2對膽汁形成和膽汁脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

有研究發(fā)現(xiàn)，在ABCG5和ABCG8兩種基因單獨(dú)缺失或都缺失的小鼠肝臟中膽固醇分泌顯著降低，但沒有完全消除，這表明存在一種ABCG5/G8非依賴通路可調(diào)節(jié)人體和小鼠的膽汁膽固醇分泌。

Wang等研究者指出，在成石狀態(tài)下，ABCG5/G8非依賴通路膽固醇輸出占總量的30%至40%，在高膽固醇飲食中調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇分泌上起著關(guān)鍵作用。在ABCG5/G8缺失的情況下，這種途徑參與了膽固醇的分泌和膽結(jié)石形成。與ABCG5/G8不同的是，這種通路途徑并不是由LXR通過其信號(hào)通路激活的。這一發(fā)現(xiàn)表明了ABCG5/G8依賴性和ABCG5/G8非依賴性通路在肝臟膽固醇分泌和膽囊結(jié)石形成中都發(fā)揮著重要作用。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，腸道膽囊收縮素（CCK）的分泌和膽囊排空受高脂飲食的破壞，但腹腔疾病對膽結(jié)石形成的影響目前很少有研究。Wang等人建立CCK缺乏小鼠模型來研究腹腔疾病對膽汁分泌的影響，發(fā)現(xiàn)CCK基因敲除后小鼠表現(xiàn)膽囊排空受損，小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間減少，腸道膽固醇吸收增加，過量的腸道源性膽固醇導(dǎo)致膽汁高分泌，從而引起膽固醇結(jié)晶和膽石形成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)效CCK-1受體拮抗劑Devaxipide通過損害小鼠膽囊排空功能，擾亂膽固醇代謝和增強(qiáng)腸道膽固醇吸收，增加了膽結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。上述實(shí)驗(yàn)為研究腹腔疾病患者膽結(jié)石的發(fā)病機(jī)制提供了重要依據(jù)。

膽汁中可能同時(shí)含有促核因子和抗核因子，其含量的不平衡可能導(dǎo)致膽固醇快速結(jié)晶從而形成結(jié)石，但這一說法仍需要更多的研究來證實(shí)。粘蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)膽固醇結(jié)晶成石的蛋白分子，還有許多其他蛋白也被認(rèn)為是影響膽汁中膽固醇結(jié)晶的促核因子或抗核因子，但它們作用機(jī)制仍不清楚。

Niemann Pick C2（NPC2）是一種可溶性溶酶體蛋白，通過激活A(yù)BCG5/G8介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路來調(diào)節(jié)肝臟膽固醇分泌，它促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠（人NPC2基因）的膽固醇結(jié)晶和膽石形成。相比而言，NPC2基因缺乏的小鼠在高膽固醇飼料飼喂2周后肝臟膽固醇分泌和膽石率減少。上述結(jié)果表明，這些膽汁蛋白可能通過膽汁中的液晶途徑來調(diào)節(jié)膽固醇的結(jié)晶以導(dǎo)致膽結(jié)石發(fā)生。

腸道膽固醇的高效率吸收和高膽固醇飲食（西方飲食模式）是小鼠的兩個(gè)致石因素。深入研究發(fā)現(xiàn)，有很多因素都可以在腸道膽固醇吸收、運(yùn)送致肝臟并分泌于膽汁中的途徑上影響膽固醇的結(jié)晶而導(dǎo)致膽結(jié)石的形成，如膽固醇酯化、腸細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、乳糜微粒的聚集等。此外，腸道微生物群和免疫系統(tǒng)對膽結(jié)石形成也有重要的影響，但仍待進(jìn)一步深入研究。

因此，那些影響肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和膽汁分泌膽固醇、磷脂和膽汁酸的因素都可以通過引起膽固醇高分泌和膽固醇過飽和膽汁來促進(jìn)膽結(jié)石的形成。一些受體，如liver X receptor (LXR)、farnesoid X receptor(FXR)、pregnane X receptor (PXR)、constitutive androstane receptor (CAR)、 ERa等可以通過肝臟脂質(zhì)代謝的途徑來影響膽結(jié)石的形成。還有，對肝臟胰島素受體的破壞也能提高小鼠膽結(jié)石的發(fā)病率，這種破壞可以降低膽固醇7a羥化酶的活性并影響膽汁酸的合成，但胰島素抵抗在膽結(jié)石形成中的作用機(jī)制也尚不明確。

結(jié)論

上述小鼠膽結(jié)石研究的成果為研究同源人類結(jié)石基因和探索人類膽石形成的機(jī)制打開了大門。在未來的研究中，小鼠模型建立和膽結(jié)石研究和應(yīng)聚焦于核受體、腸道微生物群、血脂、高胰島素血癥、非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病、衰老以及不運(yùn)動(dòng)的生活方式等方面對膽結(jié)石形成的影響。這些小鼠模型實(shí)驗(yàn)將為肝膽疾病的治療提供新的依據(jù)。

本文來源：Mouse Models Of Gallstone Disease；Tony Y. Wang/Piero Portincasa著