MCD飼料誘導(dǎo)大、小鼠NASH模型的對(duì)比研究

非酒精脂肪性肝炎（NASH）是一種無(wú)過(guò)量飲酒，以肝臟細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉炎癥為主要臨床病理特征的綜合征。它是非酒精脂肪性肝?。∟AFLD）發(fā)展為肝硬化和肝癌的一個(gè)重要階段。據(jù)報(bào)道NAFLD在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率表現(xiàn)為成人30%、兒童13%，其中大約有10%的NAFLD患者發(fā)展成為NASH，而NASH患者中的10%會(huì)發(fā)展成為肝硬化，甚至肝癌。

非酒精脂肪性肝炎已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)，然而NASH的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)其與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、瘦素、Kupffer細(xì)胞等多種因素相關(guān)。目前臨床上的藥物普遍存在毒副作用較大、價(jià)格昂貴等問(wèn)題，而被證實(shí)的有效且無(wú)副作用治療方法僅有適當(dāng)?shù)臐u進(jìn)性減肥運(yùn)動(dòng)這一項(xiàng)。 因此探索新型無(wú)毒副作用藥物對(duì)其N(xiāo)ASH臨床治療具有重要意義，而可靠的動(dòng)物模型對(duì)探索NASH的發(fā)病機(jī)制及防治發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

目前國(guó)內(nèi)外的NASH模型主要包括3類(lèi)：

① 營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型，它包括了高脂飲食脂肪肝動(dòng)物模型、高糖飲食脂肪肝動(dòng)物模型和蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）脂肪肝動(dòng)物模型。

② 復(fù)合因素誘導(dǎo)的NASH模型，主要是以高脂肪飼料加化學(xué)藥物來(lái)進(jìn)行造模，包括四氯化碳脂肪肝動(dòng)物模型、四環(huán)素脂肪肝動(dòng)物模型、乙硫氨酸脂肪肝動(dòng)物模型。

③ 特殊品系脂肪肝動(dòng)物模型，主要有瘦素缺乏和抵抗小鼠模型、PTEN基因敲除小鼠模型。其中，MCD飼料誘導(dǎo)的NASH模型是目前國(guó)際上被廣泛認(rèn)可的模型。

該模型最早由Shinozuka提出，起初是用于探討飲食因素對(duì)肝臟腫瘤形成的影響，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在短期內(nèi)可以引起脂肪性肝炎。該模型的脂肪性肝炎發(fā)展速度快，其病理病變與人類(lèi)的NASH類(lèi)似，因此成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究NASH的熱點(diǎn)模型，但未見(jiàn)關(guān)于在大小鼠體內(nèi)用MCD飼料誘導(dǎo)NASH模型差異比較的報(bào)道。

本研究旨在通過(guò)MCD飼料分別建立大、小鼠NASH模型，比較其生化和病理指標(biāo)，探討兩種動(dòng)物模型的差異，為NASH的基礎(chǔ)研究和防治藥物的開(kāi)發(fā)提供可靠的動(dòng)物模型。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠18只，8~9周齡，體重為22~25 g；SPF級(jí)SD雄性大鼠18只，8~9周齡，體重為300~350g。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，屏障環(huán)境動(dòng)物房室溫（22 ±1）° ，相對(duì)濕度30%~60%，12h光照/12h黑暗，動(dòng)物自由采食和飲水。

實(shí)驗(yàn)試劑

檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）含量的試劑盒，均購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷公司，按說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行檢測(cè)。

動(dòng)物飼料

蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料和蛋氨酸膽堿充足（MCS）飼料，根據(jù)飼料生產(chǎn)公司技術(shù)人員的指導(dǎo)進(jìn)行飼養(yǎng)。

動(dòng)物分組

將18只C57BL/6小鼠和18只SD大鼠分別隨機(jī)分成正常組（飼喂MCS飼料）和模型組（飼喂MCD飼料）。模型組需要1周過(guò)渡性飼料的喂養(yǎng)，第1 ~3天將MCS和 MCD飼料按2:1混合后喂養(yǎng)，第4 ~5天按1:1混合喂養(yǎng)，第6-7天按1:2混合喂養(yǎng)，1周后完全投喂MCD飼料。過(guò)渡性飼養(yǎng)后的第3、5、8周在各組中分別隨機(jī)選取6只動(dòng)物樣本，進(jìn)行肝功能生化指標(biāo)和肝臟病理的檢測(cè)。從過(guò)渡飼喂開(kāi)始且每周稱(chēng)量動(dòng)物體質(zhì)量（g）并記錄。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

體質(zhì)量變化

正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量逐漸減輕；從第 3周開(kāi)始，相比于正常組，模型組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量都顯著降低。

動(dòng)物血清中ALT、AST、TC和TG的含量

從第3周開(kāi)始，模型組小鼠肝酶AST和ALT水平與正常組相比，均已顯著升高。相比之下，大鼠模型組在檢測(cè)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，肝酶AST水平無(wú)顯著變化，而ALT水平從第3周開(kāi)始顯著升高。在檢測(cè)的造模后第3周、5周、8 周，大、小鼠血清中TG和TC含量均顯著降低。

肝組織HE染色

正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排 列,無(wú)肝細(xì)胞氣球樣變或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖1A、C）。MCD飼料飼喂8周后，模型組的大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)已被破壞，大泡性氣球樣變細(xì)胞占了總細(xì)胞的2/3以上，以肝小葉周邊脂肪變性最為嚴(yán)重， 局部可見(jiàn)大泡性氣球樣變和以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主炎癥反應(yīng)（見(jiàn)圖1B）。8周時(shí)模型組小鼠肝組織光鏡下見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變 性，中央靜脈周?chē)霈F(xiàn)嚴(yán)重、以浸潤(rùn)為主的局灶壞 死性炎癥（見(jiàn)圖1D）。具體NAFLD活動(dòng)度積分見(jiàn)表3，SD大鼠和C57BL/6小鼠綜合評(píng)分均表現(xiàn)為模型組與正常組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0. 05）。

實(shí)驗(yàn)討論

MCD飼料誘導(dǎo)的NASH模型的主要發(fā)病機(jī)制是由于飼料缺乏膽堿而引起機(jī)體卵磷脂合成不足。蛋氨酸為合成載脂蛋白所必需的氨基酸，缺乏 酸會(huì)導(dǎo)致低密度脂蛋白膽固醇合成減少，因此無(wú)法 將三酰甘油運(yùn)出肝外而累積形成脂肪肝。另一方面，缺乏膽堿還會(huì)引起肝臟線(xiàn)粒體內(nèi)部活性氧增加，最終導(dǎo)致氧應(yīng)激增加而肝臟發(fā)生損傷。氧應(yīng)激不但導(dǎo)致細(xì)胞多種功能和結(jié)構(gòu)損傷，而且活化TNFα及其他促炎癥細(xì)胞因子^_。

該模型自1978年Shinozuka提出以來(lái)，被國(guó)內(nèi)外的學(xué)者廣泛應(yīng)用于藥物篩選，但是缺少文獻(xiàn)對(duì)該模型在C57BL/6小鼠和SD大鼠的系統(tǒng)性報(bào)道。于是本實(shí)驗(yàn)飼喂MCD飼料建立大、小鼠NASH模型，對(duì)其血液的生化指標(biāo)和肝臟的病理指標(biāo)進(jìn)行了比較，旨在探討兩種動(dòng)物模型的生化和病理差異，以選擇理想的動(dòng)物模型。

本研究的結(jié)果顯示，在肝損傷指數(shù)方面，飼喂MCD飼料的第3周開(kāi)始，模型組小鼠的肝酶AST、 ALT水平與正常組相比已經(jīng)顯著升高，但模型大鼠 AST水平從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始至結(jié)束仍無(wú)顯著差異，而AST和ALT的水平在臨床研究中通常作為肝臟功能評(píng)價(jià)重要指標(biāo)，反映脂肪肝的早期損害，因此表明C57BL/6小鼠對(duì)MCD飼料的反應(yīng)在早期比SD大鼠更敏感 ，更容易引起肝損傷肝 。

而且肝組織病理結(jié)果顯示，飼喂MCD飼料8周，模型組小鼠肝組織比大鼠出現(xiàn)的脂肪變性更嚴(yán)重，小區(qū)域出現(xiàn)小泡為主的細(xì)胞氣球樣變及輕微的炎癥反應(yīng)；同時(shí)通過(guò)肝組織病例評(píng)分結(jié)果表明8周后模型組小鼠肝組織炎癥反應(yīng)及脂肪變性等病理特征的得分明顯高于大鼠。另外，小鼠具有采食量少、成本低及操作方便等優(yōu)點(diǎn)。因此，綜合生化指標(biāo)及病理特征等因素，MCD飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠模型比SD大鼠模型更適用于進(jìn)一步研究NASH.

本文作者：崔國(guó)禎/余漢濠/黃天養(yǎng)/王文/徐義祥/程自剛/吳彩燕/李銘源，遵義醫(yī)學(xué)院