MCD飼料誘導(dǎo)大、小鼠NASH模型的對比研究

非酒精脂肪性肝炎（NASH）是一種無過量飲酒，以肝臟細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉炎癥為主要臨床病理特征的綜合征。它是非酒精脂肪性肝?。∟AFLD）發(fā)展為肝硬化和肝癌的一個重要階段。據(jù)報道NAFLD在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率表現(xiàn)為成人30%、兒童13%，其中大約有10%的NAFLD患者發(fā)展成為NASH，而NASH患者中的10%會發(fā)展成為肝硬化，甚至肝癌。

非酒精脂肪性肝炎已經(jīng)成為研究的焦點，然而NASH的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)其與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、瘦素、Kupffer細(xì)胞等多種因素相關(guān)。目前臨床上的藥物普遍存在毒副作用較大、價格昂貴等問題，而被證實的有效且無副作用治療方法僅有適當(dāng)?shù)臐u進(jìn)性減肥運動這一項。 因此探索新型無毒副作用藥物對其NASH臨床治療具有重要意義，而可靠的動物模型對探索NASH的發(fā)病機(jī)制及防治發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

目前國內(nèi)外的NASH模型主要包括3類：

① 營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型，它包括了高脂飲食脂肪肝動物模型、高糖飲食脂肪肝動物模型和蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）脂肪肝動物模型。

② 復(fù)合因素誘導(dǎo)的NASH模型，主要是以高脂肪飼料加化學(xué)藥物來進(jìn)行造模，包括四氯化碳脂肪肝動物模型、四環(huán)素脂肪肝動物模型、乙硫氨酸脂肪肝動物模型。

③ 特殊品系脂肪肝動物模型，主要有瘦素缺乏和抵抗小鼠模型、PTEN基因敲除小鼠模型。其中，MCD飼料誘導(dǎo)的NASH模型是目前國際上被廣泛認(rèn)可的模型。

該模型最早由Shinozuka提出，起初是用于探討飲食因素對肝臟腫瘤形成的影響，后來發(fā)現(xiàn)在短期內(nèi)可以引起脂肪性肝炎。該模型的脂肪性肝炎發(fā)展速度快，其病理病變與人類的NASH類似，因此成為近年來國內(nèi)外學(xué)者研究NASH的熱點模型，但未見關(guān)于在大小鼠體內(nèi)用MCD飼料誘導(dǎo)NASH模型差異比較的報道。

本研究旨在通過MCD飼料分別建立大、小鼠NASH模型，比較其生化和病理指標(biāo)，探討兩種動物模型的差異，為NASH的基礎(chǔ)研究和防治藥物的開發(fā)提供可靠的動物模型。

實驗動物與方案

實驗動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠18只，8~9周齡，體重為22~25 g；SPF級SD雄性大鼠18只，8~9周齡，體重為300~350g。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，屏障環(huán)境動物房室溫（22 ±1）° ，相對濕度30%~60%，12h光照/12h黑暗，動物自由采食和飲水。

實驗試劑

檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）含量的試劑盒，均購自德國羅氏診斷公司，按說明書和文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行檢測。

動物飼料

蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料和蛋氨酸膽堿充足（MCS）飼料，根據(jù)飼料生產(chǎn)公司技術(shù)人員的指導(dǎo)進(jìn)行飼養(yǎng)。

動物分組

將18只C57BL/6小鼠和18只SD大鼠分別隨機(jī)分成正常組（飼喂MCS飼料）和模型組（飼喂MCD飼料）。模型組需要1周過渡性飼料的喂養(yǎng)，第1 ~3天將MCS和 MCD飼料按2:1混合后喂養(yǎng)，第4 ~5天按1:1混合喂養(yǎng)，第6-7天按1:2混合喂養(yǎng)，1周后完全投喂MCD飼料。過渡性飼養(yǎng)后的第3、5、8周在各組中分別隨機(jī)選取6只動物樣本，進(jìn)行肝功能生化指標(biāo)和肝臟病理的檢測。從過渡飼喂開始且每周稱量動物體質(zhì)量（g）并記錄。

實驗結(jié)果

體質(zhì)量變化

正常對照組實驗動物的體質(zhì)量持續(xù)增長，模型組實驗動物體質(zhì)量逐漸減輕；從第 3周開始，相比于正常組，模型組的實驗動物體質(zhì)量都顯著降低。

動物血清中ALT、AST、TC和TG的含量

從第3周開始，模型組小鼠肝酶AST和ALT水平與正常組相比，均已顯著升高。相比之下，大鼠模型組在檢測的3個時間點，肝酶AST水平無顯著變化，而ALT水平從第3周開始顯著升高。在檢測的造模后第3周、5周、8 周，大、小鼠血清中TG和TC含量均顯著降低。

肝組織HE染色

正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排 列,無肝細(xì)胞氣球樣變或炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1A、C）。MCD飼料飼喂8周后，模型組的大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)已被破壞，大泡性氣球樣變細(xì)胞占了總細(xì)胞的2/3以上，以肝小葉周邊脂肪變性最為嚴(yán)重， 局部可見大泡性氣球樣變和以單個核細(xì)胞浸潤為主炎癥反應(yīng)（見圖1B）。8周時模型組小鼠肝組織光鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變 性，中央靜脈周圍出現(xiàn)嚴(yán)重、以浸潤為主的局灶壞 死性炎癥（見圖1D）。具體NAFLD活動度積分見表3，SD大鼠和C57BL/6小鼠綜合評分均表現(xiàn)為模型組與正常組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0. 05）。

實驗討論

MCD飼料誘導(dǎo)的NASH模型的主要發(fā)病機(jī)制是由于飼料缺乏膽堿而引起機(jī)體卵磷脂合成不足。蛋氨酸為合成載脂蛋白所必需的氨基酸，缺乏 酸會導(dǎo)致低密度脂蛋白膽固醇合成減少，因此無法 將三酰甘油運出肝外而累積形成脂肪肝。另一方面，缺乏膽堿還會引起肝臟線粒體內(nèi)部活性氧增加，最終導(dǎo)致氧應(yīng)激增加而肝臟發(fā)生損傷。氧應(yīng)激不但導(dǎo)致細(xì)胞多種功能和結(jié)構(gòu)損傷，而且活化TNFα及其他促炎癥細(xì)胞因子^_。

該模型自1978年Shinozuka提出以來，被國內(nèi)外的學(xué)者廣泛應(yīng)用于藥物篩選，但是缺少文獻(xiàn)對該模型在C57BL/6小鼠和SD大鼠的系統(tǒng)性報道。于是本實驗飼喂MCD飼料建立大、小鼠NASH模型，對其血液的生化指標(biāo)和肝臟的病理指標(biāo)進(jìn)行了比較，旨在探討兩種動物模型的生化和病理差異，以選擇理想的動物模型。

本研究的結(jié)果顯示，在肝損傷指數(shù)方面，飼喂MCD飼料的第3周開始，模型組小鼠的肝酶AST、 ALT水平與正常組相比已經(jīng)顯著升高，但模型大鼠 AST水平從實驗開始至結(jié)束仍無顯著差異，而AST和ALT的水平在臨床研究中通常作為肝臟功能評價重要指標(biāo)，反映脂肪肝的早期損害，因此表明C57BL/6小鼠對MCD飼料的反應(yīng)在早期比SD大鼠更敏感 ，更容易引起肝損傷肝 。

而且肝組織病理結(jié)果顯示，飼喂MCD飼料8周，模型組小鼠肝組織比大鼠出現(xiàn)的脂肪變性更嚴(yán)重，小區(qū)域出現(xiàn)小泡為主的細(xì)胞氣球樣變及輕微的炎癥反應(yīng)；同時通過肝組織病例評分結(jié)果表明8周后模型組小鼠肝組織炎癥反應(yīng)及脂肪變性等病理特征的得分明顯高于大鼠。另外，小鼠具有采食量少、成本低及操作方便等優(yōu)點。因此，綜合生化指標(biāo)及病理特征等因素，MCD飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠模型比SD大鼠模型更適用于進(jìn)一步研究NASH.

本文作者：崔國禎/余漢濠/黃天養(yǎng)/王文/徐義祥/程自剛/吳彩燕/李銘源，遵義醫(yī)學(xué)院