非酒精性脂肪性肝（NAFLD）由單純性脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），而后可能發(fā)展為肝硬化。這是對(duì)人類健康的嚴(yán)重威脅。因此，研究NAFLD的形成和發(fā)展機(jī)制具有重要意義。
實(shí)驗(yàn)方法
14只8周齡的SD大鼠分為兩組，分別飼喂45%高脂肪膽堿缺乏飼料和常規(guī)飼料，飲食誘導(dǎo)過程持續(xù)44天后成功建立了NAFLD早期模型。從脂肪肝模型組（NAFL）和常規(guī)飲食對(duì)照組（CON）的大鼠獲取肝組織樣本。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與總結(jié)
隨后，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組分析。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，在NAFL和CON組中檢測到178個(gè)差異表達(dá)基因：其中105個(gè)基因上調(diào)，73個(gè)基因下調(diào)，8條通路顯著富集。脂質(zhì)組學(xué)分析共檢測到982種代謝物：其中474種代謝產(chǎn)物存在顯著差異，273種上調(diào)，201種下調(diào)，7條通路顯著富集。基于聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)了3條常見的富集通路，包括膽固醇代謝和脂肪消化吸收代謝途徑。
總結(jié)來說，在NAFLD早期階段，少量的基因改變引起了對(duì)脂質(zhì)成分的強(qiáng)烈反應(yīng)，反應(yīng)最強(qiáng)的是甘油酯和甘油磷脂。脂肪酸攝入的顯著增加伴隨著膽固醇代謝是NAFLD早期肝臟最顯著的代謝特征。在脂肪肝的早期，肝臟表現(xiàn)出NASH的特征。
實(shí)驗(yàn)流程與評(píng)估
我們比較了谷物維持飼料（脂肪熱量占比13%；碳水化合物熱量占比57%）和純化型膽堿缺乏/充足飼料（脂肪熱量占比12%；碳水化合物熱量占比69%），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇了脂質(zhì)和蛋氨酸代謝正常的C3H小鼠。在交配前2周開始進(jìn)食，一直持續(xù)到懷孕和哺乳期，然后繼續(xù)喂養(yǎng)后代到24周齡，收集血漿和肝組織研究蛋氨酸和脂質(zhì)代謝。
與谷物飼料組的小鼠相比，喂食任何一種純化型飼料的小鼠的肝臟/體重比均顯著升高，這與肝臟脂肪變性和炎癥有關(guān)。且純化飼料組的小鼠血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平較高，雌性小鼠肝臟S-腺苷甲硫氨酸（SAM）/S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）比值高于谷物飼料喂養(yǎng)的雌性小鼠（4.6±2 vs.2.8±1.9；P<0.05）。補(bǔ)充膽堿可改善純化型飼料組小鼠的某些脂質(zhì)和蛋氨酸代謝參數(shù)。
標(biāo)準(zhǔn)谷物飼料和純化型飼料對(duì)小鼠脂肪變性的發(fā)展有顯著不同的影響。這些發(fā)現(xiàn)有助于脂肪肝動(dòng)物模型的建立并為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇合適的對(duì)照飼料。
原文檢索：Effects of Nonpurified and Choline Supplemented or Nonsupplemented Purified Diets on Hepatic Steatosis and Methionine Metabolism in C3H Mice, National Center for Biotechnology Information, U.S.
]]>肝癌模型所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物涉及小鼠、大鼠、豚鼠，模型種類主要分為化學(xué)誘導(dǎo)、飲食誘導(dǎo)、移植瘤以及多種方法聯(lián)合使用。本文主要介紹通過化學(xué)和飲食誘導(dǎo)的小鼠模型。
化學(xué)誘導(dǎo)模型
化學(xué)誘導(dǎo)模型的優(yōu)點(diǎn)是與人類的損傷-纖維化-惡性循環(huán)相似。目前發(fā)現(xiàn)的致癌化合物有很多，其主要被分為以下兩種類型: ①遺傳毒性致癌物，直接導(dǎo)致DNA損傷，如二乙基亞硝胺( N-nitrosodiethylamine，DEN) 、黃曲霉毒素 B(Aflatoxin B1， AFB) 、四氯化碳( Carbon tetrachloride ，CCl4) 和硫代乙酰胺(Thioacetamide ，TAA 等; ②非遺傳毒性致癌物，促進(jìn)缺乏直接作用遺傳物質(zhì)的能力，但在由肝毒性化合物引發(fā)后增強(qiáng)腫瘤形成的化合物，如苯巴比妥(phenobarbital，PB) 、過氧化物酶體增生劑(Peroxisome proliferators ，PPs) 等。
飲食誘導(dǎo)模型
通過蛋氨酸膽堿缺乏飼料（MCD）誘導(dǎo)更嚴(yán)重的病變，其特征是1-2周內(nèi)出現(xiàn)急性胰腺炎和8-10周的肝纖維化。為了顯著減少致癌時(shí)間，乙硫氨酸（ethionine），一種非蛋白質(zhì)性細(xì)胞毒性甲酸模擬物，可以添加到膽堿缺乏飼料中（CDE），喂養(yǎng)2周就可誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖和肝星狀細(xì)胞的活化，從而引起嚴(yán)重的肝臟炎癥。還有其它方式的飲食誘導(dǎo)，例如西方飲食誘導(dǎo)的肥胖綜合癥模型、非酒精性脂肪肝（NAFLD）動(dòng)物模型等。
飲食、化學(xué)誘導(dǎo)相關(guān)的工程小鼠
通過改變條調(diào)控肝癌細(xì)胞生長、周期、發(fā)育等進(jìn)展的基因可以誘導(dǎo)腫瘤，例如c-Myc、Wnt/β-catenin、APC、PTEN等。基因工程小鼠包括組成型表達(dá)、選擇性表達(dá)、以及誘導(dǎo)性表達(dá)。組成型表達(dá)系統(tǒng)，例如完全整合了乙型肝炎病毒X蛋白HBx基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；選擇性表達(dá)系統(tǒng)，例如利用Cre/loxP重組系統(tǒng)構(gòu)建的Alb/c-myc和 MT/TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠；誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)，例如利用四環(huán)素調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的LAP-tTA和TRE-MYC小鼠。
基因工程小鼠飲食+化學(xué)試劑誘導(dǎo)操作方法
LAP-tTA和TRE-MYC小鼠，在去除雙轉(zhuǎn)基因小鼠飲用水中的強(qiáng)力霉素(100μg/ml)后，肝臟MYC表達(dá)被激活；C57BL/6小鼠以20μg/g體重腹腔注射二乙基亞硝基胺(DEN)建立化學(xué)誘導(dǎo)性HCC。12周齡雄性B6.Cg-Lepob/J (ob/ob) 小鼠在特定時(shí)間喂食蛋氨酸膽堿缺乏飼料（MCD）、膽堿缺乏氨基酸飼料（CDAA）、高脂肪飼料（HF），誘導(dǎo)NAFLD，MCD飼料中添加玉米油(10%)，不添加魚油。改良后的飼料以AIN-76A標(biāo)準(zhǔn)飼料為基礎(chǔ)，熱量等高(4.45千卡/克)，脂肪含量相同(23%)。以不同比例供應(yīng)富含亞油酸的紅花油和含飽和脂肪酸的椰子油，低亞油酸飲食含量為2%，高亞油酸飲食含量為12%。采用高亞油酸或低亞油酸飼喂C57BL/6小鼠4周。
MYC過表達(dá)的小鼠，MCD/CDAA/HF飼料喂養(yǎng)，給予或是不給予DEN喂養(yǎng)。
開發(fā)臨床前NASH纖維化模型
1. 使用四氯化碳進(jìn)行炎癥、脂肪變性和細(xì)胞死亡的毒素誘導(dǎo)
2. 通過MCD飼料誘導(dǎo)的肝脂肪變性
3. 增強(qiáng)NASH的新一代膽堿缺乏飼料，沒有早期模型中觀察到的重度體重減輕
本文對(duì)比了這些傳統(tǒng)纖維化模型，探討它們?cè)诶w維化和NASH藥物開發(fā)方面的優(yōu)勢和局限性。
四氯化碳誘導(dǎo)NASH模型
溶劑四氯化碳（CCl4）是一種毒素，通過肝臟細(xì)胞色素P450代謝為三氯甲基自由基（–CCl3）。這會(huì)與許多肝臟靶標(biāo)發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到多種類似NASH的效應(yīng)：
- 線粒體活性氧簇引發(fā)的炎癥
- 脂代謝酶活性降低和高爾基氏體驅(qū)動(dòng)的VLDL分泌受損導(dǎo)致的脂肪變性
- 廣泛的細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和纖維化
這些有害效應(yīng)在沒有肥胖或胰島素抵抗的情況下發(fā)生，并且涉及大量與脂質(zhì)貯積和代謝無關(guān)的細(xì)胞死亡。因此，這并不能代表真實(shí)的NAFLD。
除了缺乏對(duì)人類NAFLD/NASH的真正可譯性外，該模型的主要缺點(diǎn)是影響非肝臟器官和組織的全身毒性，且由于CCI4對(duì)操作人員具有潛在化學(xué)危害，所以只能由訓(xùn)練有素的技術(shù)人員執(zhí)行，必須配備適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)設(shè)備和化學(xué)安全基礎(chǔ)設(shè)施。
MCD飼料誘導(dǎo)NASH模型
蛋氨酸和膽堿是肝線粒體β氧化和極低密度脂蛋白（VLDL）合成所需的關(guān)鍵營養(yǎng)素。喂食MCD飼料時(shí)，甘油三酸酯的輸出受到抑制，從而迅速誘導(dǎo)肝脂肪變性和炎癥。
和CCl4一樣，MCD飼料因其易用性和快速誘導(dǎo)而廣受歡迎。兩周內(nèi)血清ALT/AST穩(wěn)健上升，并且臨床NAFLD活性評(píng)分在同一時(shí)間段內(nèi)接近最大值。纖維化也迅速發(fā)生，在短短4周內(nèi)就很明顯，10周內(nèi)達(dá)到重度。在不超過16周的過程中，纖維化是可逆的，因此應(yīng)在更長的時(shí)間范圍內(nèi)運(yùn)行模型，以評(píng)價(jià)可改善NASH的藥物。但是，動(dòng)物選擇比CCl4模型受到更多限制，C57Bl/6小鼠是首選的易感小鼠品系；大鼠會(huì)進(jìn)展為穩(wěn)健的脂肪變性，但只有輕微炎癥，且沒有纖維化。
MCD模型有許多轉(zhuǎn)譯和實(shí)踐方面的缺點(diǎn)，最明顯的是，動(dòng)物經(jīng)歷了快速而嚴(yán)重的體重減輕（從喂食MCD飼料開始超過40%），以及血清葡萄糖、甘油三酸酯和膽固醇降低。體重減輕也造成操作人員在動(dòng)物處置和給藥方面的難度，而代謝表型則與人類狀況直接相反。
第二代膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)NASH模型
經(jīng)證明，第二代膽堿缺乏飼料可在嚙齒動(dòng)物中誘導(dǎo)NAFLD/NASH，而不會(huì)出現(xiàn)MCD飼料飼喂時(shí)的重度體重減輕。膽堿缺乏性氨基酸（CDAA）飲食可以用精確等量的左旋氨基酸代替蛋白質(zhì)含量，接受該飼料的C57Bl/6小鼠在3周內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性和炎癥，纖維化發(fā)生在第6周，并在第21周左右變?yōu)檩p度至中度，這也是可逆的。
這種飲食也適合Wistar大鼠誘導(dǎo)NAFLD/NASH，并且與小鼠的疾病發(fā)作和進(jìn)展時(shí)間范圍相近。盡管任何嚙齒動(dòng)物體重減輕都不是該模型的缺點(diǎn)，但是該模型中不存在NAFLD之前的人類代謝表型（胰島素抵抗、高血糖癥、脂血癥等）。
CDAA飼料的熱量脂肪含量從10-20％增加至60％（高脂膽堿缺乏飼料）會(huì)加速并加重NASH，并顯著降低纖維化的自發(fā)可逆性。在C57Bl/6小鼠中，該模型還將在24周內(nèi)發(fā)展為肝硬化、門靜脈高壓和肝功能衰竭，因此對(duì)于肝臟疾病研究項(xiàng)目而言具有多種用途。然而，在膽堿缺乏飲食的迭代中，沒有肥胖、高血糖癥和高甘油三酯血癥等代謝綜合征的特征。
結(jié)論
經(jīng)典的CCl4肝臟毒性模型以及膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的脂肪變性的多次迭代，為NASH和肝纖維化提供了一套特征明確且廣泛可用的嚙齒動(dòng)物模型。在選擇四氯化碳或膽堿缺乏飲食模型時(shí)，應(yīng)結(jié)合它們的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)考慮其在人體條件下可譯性方面的諸多局限性。
本文作者：中美冠科生物
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