譯者導(dǎo)讀：這是一篇關(guān)于構(gòu)建小鼠膽結(jié)石疾病模型以研究人類膽結(jié)石形成機(jī)制的文章，該文論述了小鼠膽結(jié)石模型建立的研究歷程，指出了人類膽結(jié)石形成機(jī)制的新思路。

重點(diǎn)是，文章總結(jié)了諸多研究的過(guò)程與結(jié)果，這些研究通過(guò)結(jié)合基因組學(xué)方法和小鼠表型研究成功鑒定了Lith基因，為人類Lith基因的發(fā)現(xiàn)推平道路。用基因敲除或轉(zhuǎn)基因方法為膽結(jié)石這種“古老而又新鮮”的肝膽疾病的病理生理學(xué)研究提供了新的視角。對(duì)于從事膽結(jié)石課題研究、動(dòng)物模型建立、高膽固醇飼料制備等工作的研究者來(lái)說(shuō)，此文值得一讀。

作者：Tony Y. Wang、Piero Portincasa等

譯者：協(xié)同生物蘇永騰博士

前言

膽結(jié)石是最常見的肝膽疾病之一，12%美國(guó)成年人深受其害，為減少膽結(jié)石的發(fā)病率、死亡率，深入研究膽結(jié)石的病理生理學(xué)將有助于開發(fā)出創(chuàng)新有效的治療方法。

從20世紀(jì)50年代開始，研究者就通過(guò)給倉(cāng)鼠、老鼠、豚鼠、兔子和猴子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)數(shù)周到幾個(gè)月的高膽固醇飼料并成功建立了膽結(jié)石模型，從而根據(jù)模型研究膽結(jié)石疾病的發(fā)病機(jī)制。直至上世紀(jì)90年代，第一個(gè)與膽結(jié)石相關(guān)的基因-Lith1在近交系C57L/J小鼠中得以鑒定。

我們通過(guò)此文介紹小鼠膽結(jié)石模型的建立、模型對(duì)遺傳研究以及膽結(jié)石病理生理學(xué)研究的貢獻(xiàn)，為膽結(jié)石研究做一個(gè)概覽綜述。

小鼠膽結(jié)石模型的建立

Tepperman等研究者率先發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)膽固醇和膽酸的組合使用來(lái)建立小鼠膽結(jié)石模型。在喂養(yǎng)含有膽固醇和膽酸的飼料后，發(fā)現(xiàn)從小鼠膽石中提取出來(lái)的甾醇基本上是膽固醇，占了結(jié)石總重量的94%，而單獨(dú)喂養(yǎng)1%膽固醇飼料2-8個(gè)月卻不能誘發(fā)出膽結(jié)石。由此可見，膽酸在小鼠膽結(jié)石模型建立中必不可少。

1978年，F(xiàn)ujihira等研究者給七種近交系小鼠飼喂高膽固醇飼料8周后觀察到小鼠出現(xiàn)膽結(jié)石，患病率從0%到100%不等。Alexander和Portman等人的研究進(jìn)一步確認(rèn)了小鼠在高膽固醇飼料的喂養(yǎng)下，膽結(jié)石患病率存在品系差異，這些研究分析為小鼠膽結(jié)石病基因研究打下了良好基礎(chǔ)。

更重要的是，Wang等人發(fā)現(xiàn)小鼠喂養(yǎng)高膽固醇飼料8周內(nèi)膽固醇結(jié)晶和膽結(jié)石形成的具體過(guò)程，先是粘蛋白凝膠的初始積累，繼而出現(xiàn)無(wú)水或液晶狀外觀，然后這些膽固醇晶體聚集，最后出現(xiàn)砂質(zhì)結(jié)石和真膽結(jié)石（見下圖）。

膽結(jié)石易感小鼠C57L/J飼喂高膽固醇飼料8周內(nèi)膽固醇結(jié)晶和膽結(jié)石形成的顯微照片（用相襯法，偏光顯微鏡）

（a）粘蛋白凝膠；（b）小液晶；（c）聚集液晶；（d）具有麥芽交叉雙折射和焦點(diǎn)圓錐結(jié)構(gòu)的熔融液晶；（e）弧形（可能是無(wú)水膽固醇）晶體；（f）絲狀晶體；（g）端部管狀晶體破裂產(chǎn)生膽固醇一水合物晶體；（h）典型的膽固醇一水合物晶體，從28和100.88的角度；（i）聚集的膽固醇一水合物晶體；（j和k）砂質(zhì)結(jié)石；（l）膽結(jié)石。

小鼠模型對(duì)膽結(jié)石遺傳學(xué)研究的貢獻(xiàn)

流行病學(xué)和臨床調(diào)查（如對(duì)不同家庭和雙胞胎的相關(guān)調(diào)查）研究已很清楚地表明了遺傳基礎(chǔ)在個(gè)體患膽結(jié)石病方面發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。然而，人們還沒有全部掌握遺傳因素對(duì)膽結(jié)石的影響，因?yàn)槟懡Y(jié)石是由多種環(huán)境因素以及未知基因相互作用和復(fù)雜調(diào)控引起的。

此外，為了定量研究多基因性狀，常規(guī)單基因性狀遺傳作圖法不適用于膽結(jié)石研究。近交系老鼠有著優(yōu)良的遺傳資源，是研究膽結(jié)石遺傳學(xué)的優(yōu)選動(dòng)物模型。Khanuja等人在給實(shí)驗(yàn)小鼠飼喂高膽固醇飼料12周后，率先發(fā)現(xiàn)了膽結(jié)石易感鼠C57L/J和抗膽結(jié)石鼠AKR/J之間成石的差異是由兩個(gè)Lith基因決定——Lith1和Lith2.

隨后，C57L/J和AKR/J小鼠的肝、膽囊、小腸等部位都被用來(lái)進(jìn)行了系統(tǒng)的基因表型對(duì)比研究。為了判斷Lith1和Lith2兩個(gè)基因中哪個(gè)單獨(dú)誘導(dǎo)膽結(jié)石的產(chǎn)生，攜帶Lith1的C57L/J小鼠（膽結(jié)石易感）或Lith2等位基因的AKR/J小鼠（抗膽結(jié)石）模型被建立并進(jìn)行致石研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lith1和Lith2通過(guò)不同的成石機(jī)制誘導(dǎo)膽結(jié)石的發(fā)生，Lith1調(diào)控膽固醇的代謝，Lith2則與膽汁酸分泌密切相關(guān)。

研究者通過(guò)更多的近交系小鼠膽結(jié)石模型研究發(fā)現(xiàn)，還有更多Lith基因參與膽結(jié)石的成石調(diào)控，Lith基因家族Lith1～Lith25在染色體上的分布如下圖所示。

膽結(jié)石（Lith）基因圖譜

一條垂直線代表一條染色體，著絲粒在頂端。距著絲粒（水平黑線）的遺傳距離顯示在染色體的左側(cè)。膽結(jié)石QTL（Lith基因）和候選基因的位置用水平黑線表示，基因符號(hào)在右邊（基因符號(hào)和名稱略）。

因?yàn)槿祟惡托∈笕旧w同源的原因，以上這些來(lái)自小鼠的基因研究對(duì)人類的Lith基因的發(fā)現(xiàn)有著指導(dǎo)性的作用，并成功證實(shí)了人類的LITH基因ABCG5/G8。

研究者先是在小鼠身上發(fā)現(xiàn)和鑒定了ABCG5/G8基因，隨后在德國(guó)人和智利人身上發(fā)現(xiàn)ABCG5/G8的兩個(gè)相關(guān)變體（即ABCG5-R50C和ABCG8-D19H），之后又在中國(guó)人和印度人身上得以印證。

因此，根據(jù)小鼠的Lith基因圖譜，人類的更多Lith基因及其致病性機(jī)制將得以發(fā)現(xiàn)和闡明。2010年，研究者首次提出了膽結(jié)石病的五種發(fā)病因素（見下圖）：遺傳因素和Lith基因；肝膽固醇高分泌，導(dǎo)致膽固醇過(guò)飽（即高膽固醇飽和指數(shù)）；膽固醇結(jié)晶和固體膽固醇晶體的生長(zhǎng)；膽囊運(yùn)動(dòng)受損；腸道因素，包括吸收的膽固醇從小腸輸送到肝臟引起膽汁高分泌，以及腸道微生物群的變化。

五種因素的相互作用示意圖：（i）遺傳因素和Lith基因；（ii）肝臟高分泌；（iii）膽囊動(dòng)力低下；（iv）快速相變以及（v）腸道因素。持續(xù)性肝膽固醇高分泌是遺傳因素調(diào)控的結(jié)果，導(dǎo)致膽固醇過(guò)飽和膽汁的形成，加速膽固醇結(jié)晶。膽囊運(yùn)動(dòng)功能受損可導(dǎo)致多余粘蛋白凝膠的產(chǎn)生和積累，促進(jìn)膽泥的形成和微小結(jié)石的生長(zhǎng)。這些改變也破壞了膽汁酸（腸道因素）的肝腸循環(huán)動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致腸道吸收和膽汁酸池的變化。膽固醇吸收的增加將過(guò)量膽固醇輸送到肝臟，分泌到膽汁中。腸道微生物群的異?？赡軙?huì)破壞肝臟、腸道和膽汁中膽固醇和膽汁酸的代謝，并損害膽囊的排空和再灌注。

可見，膽固醇晶體的快速生長(zhǎng)、聚集形成微小結(jié)石、最終成石這一結(jié)果都是由于膽固醇過(guò)飽和導(dǎo)致的，還有就是膽囊粘液的高分泌以及膽囊受損的凝膠形成，最終導(dǎo)致了膽泥（即膽結(jié)石的前體物）的形成。

膽結(jié)石病理生理學(xué)研究最新進(jìn)展

研究發(fā)現(xiàn)女性膽結(jié)石患病率明顯較高于同年齡段的男性，這意味著雌激素在膽結(jié)石的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵性的影響。盡管雌激素受體a（ERa）能通過(guò)調(diào)控雌二醇（E2）的形成來(lái)誘導(dǎo)雌性小鼠膽結(jié)石的發(fā)生，但E2對(duì)小鼠的致石機(jī)理尚不明確。

一些研究發(fā)現(xiàn)，ERa基因敲除小鼠大劑量E2處理后仍發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石。此外，有人發(fā)現(xiàn)名為L(zhǎng)ith18G的一種膽結(jié)石基因同時(shí)也是一種雌激素受體——G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）。這一發(fā)現(xiàn)帶來(lái)了一個(gè)新問題，E2是如何通過(guò)有效綁定并激活GPR30和ERa來(lái)影響膽結(jié)石的形成呢？

為了區(qū)分ERa和GPR30的致石作用，需要對(duì)整個(gè)膽固醇的結(jié)晶路徑和順序去探究。通過(guò)雌性野生型卵巢切除、GPR30敲除、ERa敲除和GPR30/ERa雙基因敲除等方法進(jìn)行分析研究。E2分別與GPR30以及ERa結(jié)合后，激活了液晶和無(wú)水晶體的產(chǎn)生，使得膽汁從過(guò)飽和狀態(tài)進(jìn)化到中間體結(jié)晶物。

此外，在GPR30/ERa-DKO小鼠模型中，膽固醇的結(jié)晶明顯受阻。這表明GPR30與ERa在促進(jìn)E2誘導(dǎo)的膽結(jié)石發(fā)生中具有協(xié)同作用。由于GPR30主要存在于肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而不是細(xì)胞核內(nèi)，其可能是通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑抑制肝臟膽固醇7a羥化酶和膽汁酸的合成，導(dǎo)致肝臟過(guò)量分泌膽固醇并成石。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是膽結(jié)石形成的一個(gè)重要影響因素，NAFLD與膽結(jié)石之間的聯(lián)系機(jī)制仍不清楚。缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF1）是調(diào)節(jié)氧傳遞、細(xì)胞生長(zhǎng)和氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)。

HIF1A主要存在于肝臟的周圍靜脈，即生理性缺氧的區(qū)域中。肝臟脂肪變性時(shí)，脂質(zhì)的積累使肝細(xì)胞的體積明顯增大，循環(huán)減少而最終導(dǎo)致缺氧。Asai等研究發(fā)現(xiàn)，在HIF1A基因敲除小鼠中，一種負(fù)責(zé)將肝臟分泌液分泌到膽管的水通道蛋白-8（AQP-8）的表達(dá)顯著增加。這些變化使膽汁流量顯著增加35%，膽囊和肝臟膽汁中的膽汁脂質(zhì)濃度降低36%，并減輕了膽囊的炎癥。

結(jié)果，肝臟特異性HIF1A基因敲除小鼠的膽固醇結(jié)晶被抑制，膽結(jié)石的形成也被阻止。相反，在飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性中，由于HIF1A通路的激活，野生型小鼠肝臟加速了膽結(jié)石的形成。此外，在伴有膽結(jié)石的NAFLD患者肝臟中HIF1A及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)增加，這種結(jié)果提示了HIF1A在NAFLD患者的膽結(jié)石中發(fā)揮了重要影響。膽汁的流動(dòng)是由膽汁酸依賴性和非膽汁酸依賴性兩種途徑?jīng)Q定，水和離子/非離子溶質(zhì)通過(guò)跨細(xì)胞和細(xì)胞旁途徑經(jīng)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)促使了膽汁的形成。

Cludin 2（Cldn2）是一種細(xì)胞旁通道形成蛋白，在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中高度表達(dá)。Matsumoto研究發(fā)現(xiàn)Cldn2基因敲除小鼠的膽汁流速與野生型小鼠相比降低了50%，這是由于肝膽系統(tǒng)的水滲透性降低所致，從而顯著增加膽汁中的總脂質(zhì)濃度。4周后，Cldn2基因敲除小鼠產(chǎn)生了膽結(jié)石，而野生型小鼠并沒有出現(xiàn)結(jié)石，這表明Cldn2對(duì)膽汁形成和膽汁脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

有研究發(fā)現(xiàn)，在ABCG5和ABCG8兩種基因單獨(dú)缺失或都缺失的小鼠肝臟中膽固醇分泌顯著降低，但沒有完全消除，這表明存在一種ABCG5/G8非依賴通路可調(diào)節(jié)人體和小鼠的膽汁膽固醇分泌。

Wang等研究者指出，在成石狀態(tài)下，ABCG5/G8非依賴通路膽固醇輸出占總量的30%至40%，在高膽固醇飲食中調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇分泌上起著關(guān)鍵作用。在ABCG5/G8缺失的情況下，這種途徑參與了膽固醇的分泌和膽結(jié)石形成。與ABCG5/G8不同的是，這種通路途徑并不是由LXR通過(guò)其信號(hào)通路激活的。這一發(fā)現(xiàn)表明了ABCG5/G8依賴性和ABCG5/G8非依賴性通路在肝臟膽固醇分泌和膽囊結(jié)石形成中都發(fā)揮著重要作用。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，腸道膽囊收縮素（CCK）的分泌和膽囊排空受高脂飲食的破壞，但腹腔疾病對(duì)膽結(jié)石形成的影響目前很少有研究。Wang等人建立CCK缺乏小鼠模型來(lái)研究腹腔疾病對(duì)膽汁分泌的影響，發(fā)現(xiàn)CCK基因敲除后小鼠表現(xiàn)膽囊排空受損，小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間減少，腸道膽固醇吸收增加，過(guò)量的腸道源性膽固醇導(dǎo)致膽汁高分泌，從而引起膽固醇結(jié)晶和膽石形成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)效CCK-1受體拮抗劑Devaxipide通過(guò)損害小鼠膽囊排空功能，擾亂膽固醇代謝和增強(qiáng)腸道膽固醇吸收，增加了膽結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。上述實(shí)驗(yàn)為研究腹腔疾病患者膽結(jié)石的發(fā)病機(jī)制提供了重要依據(jù)。

膽汁中可能同時(shí)含有促核因子和抗核因子，其含量的不平衡可能導(dǎo)致膽固醇快速結(jié)晶從而形成結(jié)石，但這一說(shuō)法仍需要更多的研究來(lái)證實(shí)。粘蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)膽固醇結(jié)晶成石的蛋白分子，還有許多其他蛋白也被認(rèn)為是影響膽汁中膽固醇結(jié)晶的促核因子或抗核因子，但它們作用機(jī)制仍不清楚。

Niemann Pick C2（NPC2）是一種可溶性溶酶體蛋白，通過(guò)激活A(yù)BCG5/G8介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路來(lái)調(diào)節(jié)肝臟膽固醇分泌，它促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠（人NPC2基因）的膽固醇結(jié)晶和膽石形成。相比而言，NPC2基因缺乏的小鼠在高膽固醇飼料飼喂2周后肝臟膽固醇分泌和膽石率減少。上述結(jié)果表明，這些膽汁蛋白可能通過(guò)膽汁中的液晶途徑來(lái)調(diào)節(jié)膽固醇的結(jié)晶以導(dǎo)致膽結(jié)石發(fā)生。

腸道膽固醇的高效率吸收和高膽固醇飲食（西方飲食模式）是小鼠的兩個(gè)致石因素。深入研究發(fā)現(xiàn)，有很多因素都可以在腸道膽固醇吸收、運(yùn)送致肝臟并分泌于膽汁中的途徑上影響膽固醇的結(jié)晶而導(dǎo)致膽結(jié)石的形成，如膽固醇酯化、腸細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、乳糜微粒的聚集等。此外，腸道微生物群和免疫系統(tǒng)對(duì)膽結(jié)石形成也有重要的影響，但仍待進(jìn)一步深入研究。

因此，那些影響肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和膽汁分泌膽固醇、磷脂和膽汁酸的因素都可以通過(guò)引起膽固醇高分泌和膽固醇過(guò)飽和膽汁來(lái)促進(jìn)膽結(jié)石的形成。一些受體，如liver X receptor (LXR)、farnesoid X receptor(FXR)、pregnane X receptor (PXR)、constitutive androstane receptor (CAR)、 ERa等可以通過(guò)肝臟脂質(zhì)代謝的途徑來(lái)影響膽結(jié)石的形成。還有，對(duì)肝臟胰島素受體的破壞也能提高小鼠膽結(jié)石的發(fā)病率，這種破壞可以降低膽固醇7a羥化酶的活性并影響膽汁酸的合成，但胰島素抵抗在膽結(jié)石形成中的作用機(jī)制也尚不明確。

結(jié)論

上述小鼠膽結(jié)石研究的成果為研究同源人類結(jié)石基因和探索人類膽石形成的機(jī)制打開了大門。在未來(lái)的研究中，小鼠模型建立和膽結(jié)石研究和應(yīng)聚焦于核受體、腸道微生物群、血脂、高胰島素血癥、非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病、衰老以及不運(yùn)動(dòng)的生活方式等方面對(duì)膽結(jié)石形成的影響。這些小鼠模型實(shí)驗(yàn)將為肝膽疾病的治療提供新的依據(jù)。

本文來(lái)源：Mouse Models Of Gallstone Disease；Tony Y. Wang/Piero Portincasa著