肥胖模型——高脂高糖飼料

造模周期：8-10周

成模判定：實(shí)驗(yàn)組體重超過對照組20%(簡單判定)

胰島素抵抗模型——高脂高糖飼料

造模周期：6-8周

成模判定：① 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)測定：動(dòng)物禁食5-6h，取血測FBG和FINS，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，評估胰島素抵抗的程度。【lSI=In(FBG*FINS)-1】

② 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)：50%葡萄糖(2g/kg)空腹灌胃，割尾取血，檢測灌胃0,30,60,90,120分鐘血糖。

③ 多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明建模成功。

ニ型糖尿病模型——高脂高糖飼料

造模周期：6-8周

額外干預(yù)：STZ(鏈脲佐菌素)注射30mg/kg三次

成模判定：在胰島素抵抗基礎(chǔ)上，以2次空腹血糖≥11.1mol/L和隨機(jī)血糖≥16.7mol/L為二型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)。

非酒精性脂肪肝模型——高脂高糖飼料

造模周期：12周

成模判定：① 肝組織HE染色，用10%的中性甲醛溶液固定肝臟組織，脫水、包埋后，進(jìn)行常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下，肝細(xì)胞脂肪變性占1/3以上視為脂肪肝。

② 血清生化指標(biāo)：檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、總?cè)８视?TG)的含量。

③ 生理學(xué)指標(biāo)：肝指數(shù)=肝臟濕重(g)/體重(g)*100%.

非酒精性脂肪肝炎模型——蛋氨酸膽堿缺乏飼料

造模周期：8周

成模判定：① 肝組織HE染色，用10%的中性甲醛溶液固定肝臟組織，脫水、包埋后，進(jìn)行常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下，肝細(xì)胞脂肪變性占1/3以上且伴隨炎癥視為脂肪肝炎。

② 血清生化指標(biāo)：檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、總?cè)８视?TG)的含量。

③ 生理學(xué)指標(biāo)：肝指數(shù)=肝臟濕重(g)/體重(g)*100%.

動(dòng)脈粥樣硬化模型——高脂高膽固醇飼料

造模周期：8-12周

成模判定：① 血清生化指標(biāo)：檢測血清中總膽固醇(TC)、總?cè)８视?TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量。

② 主動(dòng)脈弓油紅O染色：分離主動(dòng)脈弓縱向剪開主動(dòng)脈，油紅O染色后在顯微鏡下觀察血管斑塊情況。

高膽固醇血癥模型——高脂高膽固醇飼料

造模周期：8周

成模判定：與對照組相比，模型組TC、TG和LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著下降(P<0.05)，視為高膽固醇血癥。

取血和測定的要求：① 取血時(shí)間應(yīng)在動(dòng)物空腹?fàn)顟B(tài)，且在上午進(jìn)行。

② 集中短時(shí)間內(nèi)取血：由于血脂的24小時(shí)節(jié)律，取血應(yīng)短時(shí)間內(nèi)對所有動(dòng)物集中取樣，避免因先后取血造成的血脂差異。

③ 血樣測定時(shí)間：取血樣后應(yīng)對新鮮血樣標(biāo)本即時(shí)或當(dāng)天測定。

高膽固醇血癥（hypercholesterolemia）是一種由血漿中低密度脂蛋白膽固醇水平過度增加引發(fā)的常見代謝紊亂疾病。它被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和缺血性心臟病等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一。

在此項(xiàng)研究中，研究人員利用兩種高膽固醇血癥小鼠模型（由高脂高膽固醇飼料誘導(dǎo)或敲除Ldlr基因），證實(shí)了血清中過量的膽固醇可增加膀胱癌小鼠移植瘤以及自發(fā)性膀胱癌的腫瘤干性，促進(jìn)膀胱癌的發(fā)展。而經(jīng)選擇性膽固醇吸收抑制劑依折麥布（Ezetimibe）處理的高膽固醇血癥荷瘤小鼠，其腫瘤干性顯著降低，腫瘤生長明顯減緩，這提示攝入的膽固醇是促使膀胱癌惡性增高的原因。

基于此，科研團(tuán)隊(duì)分析了血清中膽固醇的主要組分，最后聚焦于ox-LDL。進(jìn)一步的受體驗(yàn)證和信號通路分析發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可與膀胱癌細(xì)胞膜表面受體CD36結(jié)合，影響細(xì)胞內(nèi)JAK2-STAT3信號通路，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞干性相關(guān)基因，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖。在膀胱癌病患的臨床樣本中也證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)，即血液中過高的ox-LDL水平提示了膀胱癌病人的不良預(yù)后。

高膽固醇血癥引起腫瘤宏環(huán)境（tumor macroenvironment）中ox-LDL升高，通過CD36/JAK2/STAT3信號通路增加膀胱癌細(xì)胞干性。

該研究首次確立了高膽固醇血癥和膀胱癌的相關(guān)性，提出了ox-LDL可能成為膀胱癌進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因子，揭示了高膽固醇血癥病患血清中的ox-LDL是一種外在系統(tǒng)性的調(diào)控腫瘤干性樣細(xì)胞的重要因子，為腫瘤宏環(huán)境(tumor macroenvironment)作用于腫瘤干性調(diào)控提供了一個(gè)有力例證。

研究中也提出了抑制膽固醇吸收、中和血清中ox-LDL或靶向CD36/JAK2/STAT3信號通路均有可能成為患有高膽固醇血癥的膀胱癌患者新型干預(yù)策略。

去年美國FDA關(guān)于反式脂肪作為食品添加劑的禁令促使AMLN改良飼料的開發(fā)，改良后的飼料通常被稱為GAN（Gubra Amylin NASH）飼料。

飼喂C57BL/6J小鼠富含飽和脂肪（40%)、果糖（22%）和膽固醇（2%）的GAN飼料超過38周，對飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的代謝參數(shù)以及血漿和肝臟生物標(biāo)志物進(jìn)行評估。將來自健康人類和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的肝臟活檢組織和轉(zhuǎn)錄組特征進(jìn)行比較。與NASH患者組相比，GAN飼料誘導(dǎo)的小鼠肝臟病變表現(xiàn)出相似的形態(tài)學(xué)特征，包括大脂肪變性、小葉炎癥、肝細(xì)胞球囊變性和門周/脈絡(luò)膜纖維化。

組織形態(tài)學(xué)分析顯示，肝脂質(zhì)積累、炎癥和膠原沉積的標(biāo)志物在NASH小鼠和NASH患者樣本中均有類似的增加。NASH小鼠和NASH患者的肝活檢顯示，參與NASH發(fā)病的幾種基因表達(dá)表現(xiàn)出相似的動(dòng)力學(xué)。與NASH患者的臨床特征一致，GAN飼料誘導(dǎo)的小鼠顯示出代謝綜合證的關(guān)鍵特征，包括肥胖和糖耐量受損。GAN飼料誘導(dǎo)的小鼠模型在人類NASH的組織病理學(xué)、轉(zhuǎn)錄和代謝等方面具有良好的臨床可譯性。

評論：NASH動(dòng)物模型是臨床前研究和藥物發(fā)現(xiàn)的重要工具，GAN飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠是一種纖維性NASH模型。本研究通過直接比較GAN飼料誘導(dǎo)的小鼠和人類NASH患者的肝臟活檢組織和轉(zhuǎn)錄組變化情況來評價(jià)模型的臨床可譯性。結(jié)果表明，該小鼠模型具有良好的人類可譯性，在確定治療靶點(diǎn)和表征NASH新藥物治療方面具有良好應(yīng)用前景。

原文檢索：Human translatability of the GAN dietinduced obese mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

由圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Moley博士領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)研究小組著手更好地了解母親的健康如何影響其后代的健康。這項(xiàng)研究得到了美國國立衛(wèi)生研究院兒童健康與人類發(fā)展研究所（NICHD）的支持。

研究人員給雌性小鼠喂食高脂高糖飼料，飼料供能占比為59%脂肪、26%碳水化合物（17%蔗糖）、15%蛋白質(zhì)；對照組的小鼠喂食13%脂肪、62%碳水化合物和25%蛋白質(zhì)的常規(guī)飼料。這些小鼠從受孕前6周連續(xù)進(jìn)食，變得肥胖并出現(xiàn)代謝綜合征，它們的血糖、膽固醇和甘油三酯水平都很高。

與對照組相比，喂食高脂高糖飼料的雌性小鼠后代的肌肉有較大的線粒體和脂肪滴（上圖）。

研究人員對接下來的3代雌性后代進(jìn)行了監(jiān)測，這些小鼠都被喂食常規(guī)飼料，并與喂食常規(guī)飼料的雄性交配。觀察發(fā)現(xiàn)，肥胖雌性小鼠的后代并不肥胖，但與常規(guī)飼料喂養(yǎng)的雌性后代相比，它們的葡萄糖和胰島素水平異常，脂肪和肌肉組織也有代謝異常。

科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，被喂食高脂高糖飼料的小鼠的3代雌性后代的肌肉中都有異常的線粒體，線粒體產(chǎn)生能量并在新陳代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們含有自己的DNA，由母親傳給后代。

Moley博士表示：“我們的數(shù)據(jù)首次表明，患有代謝綜合征的小鼠可以通過雌性血系將功能失調(diào)的線粒體傳遞給3代人，卵母細(xì)胞或母親的卵子可能攜帶著在整個(gè)有機(jī)體中編程線粒體功能障礙的信息?！?/p>

原文檢索：Poor maternal diet affects future generations of mice, National Institutes of Health

「造模方法」選用5-6周齡大鼠，體重50-60g，散瞳后經(jīng)裂隙燈檢查晶體透明方可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中給予大鼠50%半乳糖飼料，自由采食及飲水，觀察白內(nèi)障，待白內(nèi)障成熟后，改為正常飲食。

「模型特點(diǎn)」給予半乳糖飼料后，第4天大鼠晶體開始出現(xiàn)周邊部囊泡，并逐漸向中心部擴(kuò)展；第7天為囊泡期；第10天皮質(zhì)明顯混濁；典型的核混濁開始于第14天，以晶體核中心出現(xiàn)致密的乳白色混濁為主要特點(diǎn)；第19天所有大鼠全部進(jìn)入成熟期白內(nèi)障階段，肉眼即可觀察到瞳孔區(qū)乳白色反光，中心區(qū)密度最大。

停止投喂半乳糖飼料后約30天，逆轉(zhuǎn)開始，肉眼可見赤道部出現(xiàn)環(huán)狀半透明區(qū)，此后半透明區(qū)逐漸向中心區(qū)擴(kuò)大，并日趨透明；45天后皮質(zhì)區(qū)基本全部變?yōu)橥该鳎严稛魴z查，透明區(qū)仍發(fā)現(xiàn)有細(xì)絲狀混濁；60天檢查僅殘留有針頭大小的核混濁。

「適用研究」半乳糖性白內(nèi)障形成的病理過程與糖尿病及老年性白內(nèi)障基本相同，因此可用于糖尿病及老年性白內(nèi)障的研究。

「模型評價(jià)」簡單易操作、成功率高，是比較成熟的白內(nèi)障動(dòng)物模型。

低含量Saa+Ade飲食和腸道菌群加劇慢性腎病進(jìn)展

為驗(yàn)證含硫氨基酸的攝入可以改善慢性腎病，作者利用慢性腎病模型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過高含量和低含量的硫氨基酸+腺嘌呤（Saa+Ade）飼料分別喂食SPF級小鼠、無菌小鼠，發(fā)現(xiàn)低含量Saa+Ade飼料組的SPF級小鼠的血清肌酐水平顯著升高，出現(xiàn)嚴(yán)重腎皮質(zhì)組織病理學(xué)變化，而同組的無菌小鼠的血清肌酐和腎損傷明顯減少；高含量Saa+Ade飼料組的SPF級小鼠和無菌小鼠表型相似，證明低含量Saa+Ade飲食加劇了慢性腎病表型，腸道菌群進(jìn)一步放大了這些影響。

用醋酸鉛或亞甲藍(lán)法檢測SPF級和無菌小鼠盲腸硫化物水平，高含量Saa+Ade飼料組的SPF級小鼠盲腸硫化物水平高于低含量Saa+Ade飼料組，而無菌小鼠盲腸硫化物水平低于SPF級小鼠，說明腸道菌群將半胱氨酸代謝為H₂S。使用16S核糖體RNA(rRNA)基因擴(kuò)增子調(diào)查，低含量與高含量Saa飼料組的SPF級小鼠之間腸道菌群成員的分類豐度沒有任何顯著差異，說明健康小鼠盲腸硫化物的差異可能是由微生物功能的改變引起，而不是微生物群落結(jié)構(gòu)的改變引起的。

大腸桿菌與飲食中的Saa相互作用減少腎損傷

人類慢性腎病患者樣本的標(biāo)準(zhǔn)化大腸桿菌平均基因豐度高于非慢性腎病對照。在無菌小鼠中定植ASF菌群，或定植ASF菌群和大腸桿菌K-12，發(fā)現(xiàn)在低含量Saa+Ade飼料組，小鼠定植ASF和大腸桿菌（ASFE）具有更高的血清肌酐和更廣泛的小管炎、小管萎縮和脫落、管周纖維化和皮質(zhì)晶體，且盲腸硫化物水平較高。說明，大腸桿菌與飲食中的Saa相互作用調(diào)節(jié)腎功能。

TnaA可能是慢性腎病宿主與微生物相互作用的靶點(diǎn)

醋酸鉛硫化物檢測實(shí)驗(yàn)表明，需氧或厭氧生長的大腸桿菌以劑量依賴性方式從半胱氨酸中產(chǎn)生硫化物，而硫化物通過生成修飾半胱氨酸殘基的多硫化物，導(dǎo)致S-硫化水合發(fā)揮作用。通過基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出212種s-硫酸化蛋白質(zhì)，其中，色氨酸酶（TnaA）可以將色氨酸降解為吲哚、丙酮酸和氨，而已知吲哚參與細(xì)菌與宿主的相互作用，還可通過靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在肝臟被氧化，產(chǎn)生尿毒癥毒素硫酸吲哚酚，所以，TnaA成為研究慢性腎病小鼠模型中宿主-微生物相互作用的一個(gè)有吸引力的靶標(biāo)。

Saa調(diào)節(jié)盲腸吲哚水平和腎功能

由于ASF細(xì)菌基因組均不編碼TnaA基因，利用LC-MS/MS無法檢測到ASF小鼠盲腸內(nèi)容物中的吲哚，暗示了大腸桿菌是該模型中吲哚的唯一生產(chǎn)者，測定了兩種飲食的ASF大腸桿菌小鼠盲腸內(nèi)容物中的吲哚，發(fā)現(xiàn)接受高含量Saa飼料的小鼠吲哚水平顯著降低，證明高含量Saa飲食不僅增加TnaAS-硫化，而且這種模式足以影響體內(nèi)TnaA活性。

代謝綜合征以胰島素抵抗為核心，高血壓、高胰島素血癥、脂代謝紊亂為其主要表現(xiàn)，將這些病理因素加至動(dòng)物體內(nèi)制作經(jīng)典的X綜合征模型有較高難度。關(guān)于代謝綜合征動(dòng)物模型的報(bào)道寥寥無幾，更無法談及重復(fù)性和可操作性。

模型建立方法：SPF級雄性SD大鼠20只，普通飼料喂養(yǎng)1周后，用尾套法測大鼠的收縮壓(SBP)。術(shù)前禁食過夜，自由飲水，用4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，無菌狀態(tài)下，分離左腎動(dòng)脈，用間隙為0.25ｍｍ的U型銀夾使左腎動(dòng)脈部分狹窄，右腎及動(dòng)脈不觸及，制造2K1C大鼠模型。

對照組大鼠進(jìn)行假手術(shù)，除不結(jié)扎腎動(dòng)脈外，其它操作相同。術(shù)后大鼠普通飼料喂養(yǎng)，術(shù)后約3天動(dòng)物恢復(fù)正常，之后每周末按前述方法測收縮壓。術(shù)后4周篩選出SBP>140ｍｍHg的大鼠，改用高果糖飼料喂養(yǎng)4周，飼料配方參照Reaven方法加以改進(jìn)。高果糖飼料中營養(yǎng)素供能占比：碳水化合物66%、脂肪12%、蛋白質(zhì)22%；普通飼料中碳水化合物60%、脂肪11%、蛋白質(zhì)29%.

模型特點(diǎn)和用途：腎性高血壓形成后高果糖飼料喂養(yǎng)1個(gè)月，可誘導(dǎo)SD大鼠出現(xiàn)典型的X綜合癥，為研究胰島素抵抗及其伴隨的心血管疾病提供了一種理想的動(dòng)物模型。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：既往文獻(xiàn)報(bào)道類似的實(shí)驗(yàn)一般采用Wistar大鼠，但本實(shí)驗(yàn)用SD大鼠也成功復(fù)制了代謝綜合征模型，因此在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇方面仍有不確定性。

譯者導(dǎo)讀：這是一篇關(guān)于構(gòu)建小鼠膽結(jié)石疾病模型以研究人類膽結(jié)石形成機(jī)制的文章，該文論述了小鼠膽結(jié)石模型建立的研究歷程，指出了人類膽結(jié)石形成機(jī)制的新思路。

重點(diǎn)是，文章總結(jié)了諸多研究的過程與結(jié)果，這些研究通過結(jié)合基因組學(xué)方法和小鼠表型研究成功鑒定了Lith基因，為人類Lith基因的發(fā)現(xiàn)推平道路。用基因敲除或轉(zhuǎn)基因方法為膽結(jié)石這種“古老而又新鮮”的肝膽疾病的病理生理學(xué)研究提供了新的視角。對于從事膽結(jié)石課題研究、動(dòng)物模型建立、高膽固醇飼料制備等工作的研究者來說，此文值得一讀。

作者：Tony Y. Wang、Piero Portincasa等

譯者：協(xié)同生物蘇永騰博士

前言

膽結(jié)石是最常見的肝膽疾病之一，12%美國成年人深受其害，為減少膽結(jié)石的發(fā)病率、死亡率，深入研究膽結(jié)石的病理生理學(xué)將有助于開發(fā)出創(chuàng)新有效的治療方法。

從20世紀(jì)50年代開始，研究者就通過給倉鼠、老鼠、豚鼠、兔子和猴子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)數(shù)周到幾個(gè)月的高膽固醇飼料并成功建立了膽結(jié)石模型，從而根據(jù)模型研究膽結(jié)石疾病的發(fā)病機(jī)制。直至上世紀(jì)90年代，第一個(gè)與膽結(jié)石相關(guān)的基因-Lith1在近交系C57L/J小鼠中得以鑒定。

我們通過此文介紹小鼠膽結(jié)石模型的建立、模型對遺傳研究以及膽結(jié)石病理生理學(xué)研究的貢獻(xiàn)，為膽結(jié)石研究做一個(gè)概覽綜述。

小鼠膽結(jié)石模型的建立

Tepperman等研究者率先發(fā)現(xiàn)可以通過膽固醇和膽酸的組合使用來建立小鼠膽結(jié)石模型。在喂養(yǎng)含有膽固醇和膽酸的飼料后，發(fā)現(xiàn)從小鼠膽石中提取出來的甾醇基本上是膽固醇，占了結(jié)石總重量的94%，而單獨(dú)喂養(yǎng)1%膽固醇飼料2-8個(gè)月卻不能誘發(fā)出膽結(jié)石。由此可見，膽酸在小鼠膽結(jié)石模型建立中必不可少。

1978年，F(xiàn)ujihira等研究者給七種近交系小鼠飼喂高膽固醇飼料8周后觀察到小鼠出現(xiàn)膽結(jié)石，患病率從0%到100%不等。Alexander和Portman等人的研究進(jìn)一步確認(rèn)了小鼠在高膽固醇飼料的喂養(yǎng)下，膽結(jié)石患病率存在品系差異，這些研究分析為小鼠膽結(jié)石病基因研究打下了良好基礎(chǔ)。

更重要的是，Wang等人發(fā)現(xiàn)小鼠喂養(yǎng)高膽固醇飼料8周內(nèi)膽固醇結(jié)晶和膽結(jié)石形成的具體過程，先是粘蛋白凝膠的初始積累，繼而出現(xiàn)無水或液晶狀外觀，然后這些膽固醇晶體聚集，最后出現(xiàn)砂質(zhì)結(jié)石和真膽結(jié)石（見下圖）。

膽結(jié)石易感小鼠C57L/J飼喂高膽固醇飼料8周內(nèi)膽固醇結(jié)晶和膽結(jié)石形成的顯微照片（用相襯法，偏光顯微鏡）

（a）粘蛋白凝膠；（b）小液晶；（c）聚集液晶；（d）具有麥芽交叉雙折射和焦點(diǎn)圓錐結(jié)構(gòu)的熔融液晶；（e）弧形（可能是無水膽固醇）晶體；（f）絲狀晶體；（g）端部管狀晶體破裂產(chǎn)生膽固醇一水合物晶體；（h）典型的膽固醇一水合物晶體，從28和100.88的角度；（i）聚集的膽固醇一水合物晶體；（j和k）砂質(zhì)結(jié)石；（l）膽結(jié)石。

小鼠模型對膽結(jié)石遺傳學(xué)研究的貢獻(xiàn)

流行病學(xué)和臨床調(diào)查（如對不同家庭和雙胞胎的相關(guān)調(diào)查）研究已很清楚地表明了遺傳基礎(chǔ)在個(gè)體患膽結(jié)石病方面發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。然而，人們還沒有全部掌握遺傳因素對膽結(jié)石的影響，因?yàn)槟懡Y(jié)石是由多種環(huán)境因素以及未知基因相互作用和復(fù)雜調(diào)控引起的。

此外，為了定量研究多基因性狀，常規(guī)單基因性狀遺傳作圖法不適用于膽結(jié)石研究。近交系老鼠有著優(yōu)良的遺傳資源，是研究膽結(jié)石遺傳學(xué)的優(yōu)選動(dòng)物模型。Khanuja等人在給實(shí)驗(yàn)小鼠飼喂高膽固醇飼料12周后，率先發(fā)現(xiàn)了膽結(jié)石易感鼠C57L/J和抗膽結(jié)石鼠AKR/J之間成石的差異是由兩個(gè)Lith基因決定——Lith1和Lith2.

隨后，C57L/J和AKR/J小鼠的肝、膽囊、小腸等部位都被用來進(jìn)行了系統(tǒng)的基因表型對比研究。為了判斷Lith1和Lith2兩個(gè)基因中哪個(gè)單獨(dú)誘導(dǎo)膽結(jié)石的產(chǎn)生，攜帶Lith1的C57L/J小鼠（膽結(jié)石易感）或Lith2等位基因的AKR/J小鼠（抗膽結(jié)石）模型被建立并進(jìn)行致石研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lith1和Lith2通過不同的成石機(jī)制誘導(dǎo)膽結(jié)石的發(fā)生，Lith1調(diào)控膽固醇的代謝，Lith2則與膽汁酸分泌密切相關(guān)。

研究者通過更多的近交系小鼠膽結(jié)石模型研究發(fā)現(xiàn)，還有更多Lith基因參與膽結(jié)石的成石調(diào)控，Lith基因家族Lith1～Lith25在染色體上的分布如下圖所示。

膽結(jié)石（Lith）基因圖譜

一條垂直線代表一條染色體，著絲粒在頂端。距著絲粒（水平黑線）的遺傳距離顯示在染色體的左側(cè)。膽結(jié)石QTL（Lith基因）和候選基因的位置用水平黑線表示，基因符號在右邊（基因符號和名稱略）。

因?yàn)槿祟惡托∈笕旧w同源的原因，以上這些來自小鼠的基因研究對人類的Lith基因的發(fā)現(xiàn)有著指導(dǎo)性的作用，并成功證實(shí)了人類的LITH基因ABCG5/G8。

研究者先是在小鼠身上發(fā)現(xiàn)和鑒定了ABCG5/G8基因，隨后在德國人和智利人身上發(fā)現(xiàn)ABCG5/G8的兩個(gè)相關(guān)變體（即ABCG5-R50C和ABCG8-D19H），之后又在中國人和印度人身上得以印證。

因此，根據(jù)小鼠的Lith基因圖譜，人類的更多Lith基因及其致病性機(jī)制將得以發(fā)現(xiàn)和闡明。2010年，研究者首次提出了膽結(jié)石病的五種發(fā)病因素（見下圖）：遺傳因素和Lith基因；肝膽固醇高分泌，導(dǎo)致膽固醇過飽（即高膽固醇飽和指數(shù)）；膽固醇結(jié)晶和固體膽固醇晶體的生長；膽囊運(yùn)動(dòng)受損；腸道因素，包括吸收的膽固醇從小腸輸送到肝臟引起膽汁高分泌，以及腸道微生物群的變化。

五種因素的相互作用示意圖：（i）遺傳因素和Lith基因；（ii）肝臟高分泌；（iii）膽囊動(dòng)力低下；（iv）快速相變以及（v）腸道因素。持續(xù)性肝膽固醇高分泌是遺傳因素調(diào)控的結(jié)果，導(dǎo)致膽固醇過飽和膽汁的形成，加速膽固醇結(jié)晶。膽囊運(yùn)動(dòng)功能受損可導(dǎo)致多余粘蛋白凝膠的產(chǎn)生和積累，促進(jìn)膽泥的形成和微小結(jié)石的生長。這些改變也破壞了膽汁酸（腸道因素）的肝腸循環(huán)動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致腸道吸收和膽汁酸池的變化。膽固醇吸收的增加將過量膽固醇輸送到肝臟，分泌到膽汁中。腸道微生物群的異?？赡軙茐母闻K、腸道和膽汁中膽固醇和膽汁酸的代謝，并損害膽囊的排空和再灌注。

可見，膽固醇晶體的快速生長、聚集形成微小結(jié)石、最終成石這一結(jié)果都是由于膽固醇過飽和導(dǎo)致的，還有就是膽囊粘液的高分泌以及膽囊受損的凝膠形成，最終導(dǎo)致了膽泥（即膽結(jié)石的前體物）的形成。

膽結(jié)石病理生理學(xué)研究最新進(jìn)展

研究發(fā)現(xiàn)女性膽結(jié)石患病率明顯較高于同年齡段的男性，這意味著雌激素在膽結(jié)石的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵性的影響。盡管雌激素受體a（ERa）能通過調(diào)控雌二醇（E2）的形成來誘導(dǎo)雌性小鼠膽結(jié)石的發(fā)生，但E2對小鼠的致石機(jī)理尚不明確。

一些研究發(fā)現(xiàn)，ERa基因敲除小鼠大劑量E2處理后仍發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石。此外，有人發(fā)現(xiàn)名為Lith18G的一種膽結(jié)石基因同時(shí)也是一種雌激素受體——G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）。這一發(fā)現(xiàn)帶來了一個(gè)新問題，E2是如何通過有效綁定并激活GPR30和ERa來影響膽結(jié)石的形成呢？

為了區(qū)分ERa和GPR30的致石作用，需要對整個(gè)膽固醇的結(jié)晶路徑和順序去探究。通過雌性野生型卵巢切除、GPR30敲除、ERa敲除和GPR30/ERa雙基因敲除等方法進(jìn)行分析研究。E2分別與GPR30以及ERa結(jié)合后，激活了液晶和無水晶體的產(chǎn)生，使得膽汁從過飽和狀態(tài)進(jìn)化到中間體結(jié)晶物。

此外，在GPR30/ERa-DKO小鼠模型中，膽固醇的結(jié)晶明顯受阻。這表明GPR30與ERa在促進(jìn)E2誘導(dǎo)的膽結(jié)石發(fā)生中具有協(xié)同作用。由于GPR30主要存在于肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而不是細(xì)胞核內(nèi)，其可能是通過表皮生長因子受體信號級聯(lián)途徑抑制肝臟膽固醇7a羥化酶和膽汁酸的合成，導(dǎo)致肝臟過量分泌膽固醇并成石。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是膽結(jié)石形成的一個(gè)重要影響因素，NAFLD與膽結(jié)石之間的聯(lián)系機(jī)制仍不清楚。缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF1）是調(diào)節(jié)氧傳遞、細(xì)胞生長和氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)機(jī)體對缺氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)。

HIF1A主要存在于肝臟的周圍靜脈，即生理性缺氧的區(qū)域中。肝臟脂肪變性時(shí)，脂質(zhì)的積累使肝細(xì)胞的體積明顯增大，循環(huán)減少而最終導(dǎo)致缺氧。Asai等研究發(fā)現(xiàn)，在HIF1A基因敲除小鼠中，一種負(fù)責(zé)將肝臟分泌液分泌到膽管的水通道蛋白-8（AQP-8）的表達(dá)顯著增加。這些變化使膽汁流量顯著增加35%，膽囊和肝臟膽汁中的膽汁脂質(zhì)濃度降低36%，并減輕了膽囊的炎癥。

結(jié)果，肝臟特異性HIF1A基因敲除小鼠的膽固醇結(jié)晶被抑制，膽結(jié)石的形成也被阻止。相反，在飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性中，由于HIF1A通路的激活，野生型小鼠肝臟加速了膽結(jié)石的形成。此外，在伴有膽結(jié)石的NAFLD患者肝臟中HIF1A及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)增加，這種結(jié)果提示了HIF1A在NAFLD患者的膽結(jié)石中發(fā)揮了重要影響。膽汁的流動(dòng)是由膽汁酸依賴性和非膽汁酸依賴性兩種途徑?jīng)Q定，水和離子/非離子溶質(zhì)通過跨細(xì)胞和細(xì)胞旁途徑經(jīng)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)促使了膽汁的形成。

Cludin 2（Cldn2）是一種細(xì)胞旁通道形成蛋白，在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中高度表達(dá)。Matsumoto研究發(fā)現(xiàn)Cldn2基因敲除小鼠的膽汁流速與野生型小鼠相比降低了50%，這是由于肝膽系統(tǒng)的水滲透性降低所致，從而顯著增加膽汁中的總脂質(zhì)濃度。4周后，Cldn2基因敲除小鼠產(chǎn)生了膽結(jié)石，而野生型小鼠并沒有出現(xiàn)結(jié)石，這表明Cldn2對膽汁形成和膽汁脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

有研究發(fā)現(xiàn)，在ABCG5和ABCG8兩種基因單獨(dú)缺失或都缺失的小鼠肝臟中膽固醇分泌顯著降低，但沒有完全消除，這表明存在一種ABCG5/G8非依賴通路可調(diào)節(jié)人體和小鼠的膽汁膽固醇分泌。

Wang等研究者指出，在成石狀態(tài)下，ABCG5/G8非依賴通路膽固醇輸出占總量的30%至40%，在高膽固醇飲食中調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇分泌上起著關(guān)鍵作用。在ABCG5/G8缺失的情況下，這種途徑參與了膽固醇的分泌和膽結(jié)石形成。與ABCG5/G8不同的是，這種通路途徑并不是由LXR通過其信號通路激活的。這一發(fā)現(xiàn)表明了ABCG5/G8依賴性和ABCG5/G8非依賴性通路在肝臟膽固醇分泌和膽囊結(jié)石形成中都發(fā)揮著重要作用。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，腸道膽囊收縮素（CCK）的分泌和膽囊排空受高脂飲食的破壞，但腹腔疾病對膽結(jié)石形成的影響目前很少有研究。Wang等人建立CCK缺乏小鼠模型來研究腹腔疾病對膽汁分泌的影響，發(fā)現(xiàn)CCK基因敲除后小鼠表現(xiàn)膽囊排空受損，小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間減少，腸道膽固醇吸收增加，過量的腸道源性膽固醇導(dǎo)致膽汁高分泌，從而引起膽固醇結(jié)晶和膽石形成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)效CCK-1受體拮抗劑Devaxipide通過損害小鼠膽囊排空功能，擾亂膽固醇代謝和增強(qiáng)腸道膽固醇吸收，增加了膽結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。上述實(shí)驗(yàn)為研究腹腔疾病患者膽結(jié)石的發(fā)病機(jī)制提供了重要依據(jù)。

膽汁中可能同時(shí)含有促核因子和抗核因子，其含量的不平衡可能導(dǎo)致膽固醇快速結(jié)晶從而形成結(jié)石，但這一說法仍需要更多的研究來證實(shí)。粘蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)膽固醇結(jié)晶成石的蛋白分子，還有許多其他蛋白也被認(rèn)為是影響膽汁中膽固醇結(jié)晶的促核因子或抗核因子，但它們作用機(jī)制仍不清楚。

Niemann Pick C2（NPC2）是一種可溶性溶酶體蛋白，通過激活A(yù)BCG5/G8介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路來調(diào)節(jié)肝臟膽固醇分泌，它促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠（人NPC2基因）的膽固醇結(jié)晶和膽石形成。相比而言，NPC2基因缺乏的小鼠在高膽固醇飼料飼喂2周后肝臟膽固醇分泌和膽石率減少。上述結(jié)果表明，這些膽汁蛋白可能通過膽汁中的液晶途徑來調(diào)節(jié)膽固醇的結(jié)晶以導(dǎo)致膽結(jié)石發(fā)生。

腸道膽固醇的高效率吸收和高膽固醇飲食（西方飲食模式）是小鼠的兩個(gè)致石因素。深入研究發(fā)現(xiàn)，有很多因素都可以在腸道膽固醇吸收、運(yùn)送致肝臟并分泌于膽汁中的途徑上影響膽固醇的結(jié)晶而導(dǎo)致膽結(jié)石的形成，如膽固醇酯化、腸細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、乳糜微粒的聚集等。此外，腸道微生物群和免疫系統(tǒng)對膽結(jié)石形成也有重要的影響，但仍待進(jìn)一步深入研究。

因此，那些影響肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和膽汁分泌膽固醇、磷脂和膽汁酸的因素都可以通過引起膽固醇高分泌和膽固醇過飽和膽汁來促進(jìn)膽結(jié)石的形成。一些受體，如liver X receptor (LXR)、farnesoid X receptor(FXR)、pregnane X receptor (PXR)、constitutive androstane receptor (CAR)、 ERa等可以通過肝臟脂質(zhì)代謝的途徑來影響膽結(jié)石的形成。還有，對肝臟胰島素受體的破壞也能提高小鼠膽結(jié)石的發(fā)病率，這種破壞可以降低膽固醇7a羥化酶的活性并影響膽汁酸的合成，但胰島素抵抗在膽結(jié)石形成中的作用機(jī)制也尚不明確。

結(jié)論

上述小鼠膽結(jié)石研究的成果為研究同源人類結(jié)石基因和探索人類膽石形成的機(jī)制打開了大門。在未來的研究中，小鼠模型建立和膽結(jié)石研究和應(yīng)聚焦于核受體、腸道微生物群、血脂、高胰島素血癥、非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病、衰老以及不運(yùn)動(dòng)的生活方式等方面對膽結(jié)石形成的影響。這些小鼠模型實(shí)驗(yàn)將為肝膽疾病的治療提供新的依據(jù)。

本文來源：Mouse Models Of Gallstone Disease；Tony Y. Wang/Piero Portincasa著

一、ApoE-/-小鼠

盡管ApoE-/-小鼠已是目前研究AS最常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，但是如果大量用于實(shí)驗(yàn)，光動(dòng)物購置費(fèi)就需要數(shù)萬元。

單純的ApoE-/-小鼠在3月齡時(shí)就會出現(xiàn)動(dòng)脈脂肪堆積，如果配合高脂飼料，會很快出現(xiàn)典型的早期AS病變，非常利于研究者對AS病變的發(fā)生、發(fā)展過程和形成機(jī)制進(jìn)行研究。

但是，飼料中膽固醇的比例不同會造成ApoE-/-小鼠病變部位的變異性。AS病變部位可能在主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈之間發(fā)生變化，病變程度上也會有差異。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂食后，AS病變通常較重，主要體現(xiàn)在血管內(nèi)膜膽固醇沉積，斑塊較重，但是很少見到斑塊破裂后血栓形成。

如果AS病變太重，對于藥物研究來說是不太有利的，可能會造成假陰性。總體來說，我們認(rèn)為高脂飼料喂食ApoE-/-小鼠誘導(dǎo)AS更適合用于研究疾病機(jī)制。

二、SD大鼠

大鼠對高脂飲食并不敏感，單純高脂飲食誘導(dǎo)是很難造模成功的。盡管有文獻(xiàn)表明在飼料中加入膽酸鈉和抗甲狀腺藥物，可以促進(jìn)膽固醇吸收，但效果仍然有限。

大鼠可能最終會有明顯高脂血癥和血管內(nèi)膜膽固醇沉積，但是難以出現(xiàn)斑塊，與人類AS病變相去甚遠(yuǎn)。不過，這也解釋了一個(gè)現(xiàn)象，即大鼠高血脂與輕病變的矛盾。

三、新西蘭兔

兔子對膽固醇吸收率可達(dá)75%-90%，而且對血脂的清除能力很弱。因此，只要給予高脂飼料喂養(yǎng)，很快就會形成AS，非常有利于短期內(nèi)藥物篩選。

高脂飼料喂食的兔子AS病變特征是內(nèi)膜脂質(zhì)沉積、中膜彈力纖維破壞，很難達(dá)到粥樣斑塊的程度，這一點(diǎn)與人類AS存在差異。但是換個(gè)角度看，兔子AS模型似乎特別適用于研究AS早期的血管內(nèi)膜、中膜損傷機(jī)制。

此外，由于長期的高脂飲食，又難以代謝，兔子經(jīng)常會出現(xiàn)肝腎功能損害。高脂飼料喂食1個(gè)月時(shí)，兔子已逐漸抗拒進(jìn)食，體重減輕，甚至可能出現(xiàn)膽固醇中毒而死亡的狀況。

兔子還有一個(gè)特征，就是對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高。高脂飲食加上生活環(huán)境不佳，兔子極易出現(xiàn)腹瀉，長期腹瀉會進(jìn)一步導(dǎo)致體液丟失、電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)，也會導(dǎo)致動(dòng)物死亡。