非酒精性脂肪肝炎（NASH）是非酒精性脂肪肝（NAFLD）的潛在進(jìn)展形式，也是當(dāng)今社會(huì)的常見肝病。盡管NASH的動(dòng)物模型有很多種，但對(duì)于最佳模型的研究還缺乏共識(shí)。所以我們旨在比較兩種被廣泛使用的小鼠模型：蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）模型和西方飲食模型。
實(shí)驗(yàn)方法
對(duì)照組小鼠喂食AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料8周，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ喂食MCD飼料8周，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ喂食西方飲食飼料（45%脂肪熱量占比，含0.2%膽固醇，以及補(bǔ)充果糖和葡萄糖的飲用水）16周，比較肝臟病理和代謝情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與評(píng)估
與人類NASH相關(guān)的代謝特征更好地被西方飲食所模仿，雖然肝臟脂肪變性（即甘油三酯積累）更嚴(yán)重，但肝臟非酯化脂肪酸含量低于MCD飼料組。另一方面，西方飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH嚴(yán)重程度和可重復(fù)性較低，表現(xiàn)為肝細(xì)胞死亡/凋亡、炎癥，導(dǎo)管反應(yīng)和纖維化較少，與人類NASH發(fā)病/進(jìn)展相關(guān)的各種機(jī)制也不太健全，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬解除調(diào)控。
以西方飲食喂養(yǎng)小鼠可模擬輕度NASH患者常見的代謝紊亂，而喂食MCD飼料可以更好地模擬導(dǎo)致人類NAFLD進(jìn)展為晚期NASH的病理生物學(xué)機(jī)制。
原文檢索：Mouse Models of Diet-Induced Nonalcoholic Steatohepatitis Reproduce the Heterogeneity of the Human Disease, PLOS ONE
產(chǎn)品貨號(hào)：XTMCD
適用動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)大/小鼠（C57、ICR、BALB/C、SD等常見品系）
適用周齡：3-4周離乳即可（若有特殊實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可根?jù)實(shí)際情況選取不同周齡的大/小鼠）
產(chǎn)品形狀：棒狀顆粒（如有特殊需求可以提供粉料等）
儲(chǔ)存方式：4℃冷藏（建議）或常溫
保質(zhì)期：3個(gè)月
建議采購(gòu)量：小鼠按照5克/只/天計(jì)算、大鼠按照25克/只/天計(jì)算
]]>開發(fā)臨床前NASH纖維化模型
1. 使用四氯化碳進(jìn)行炎癥、脂肪變性和細(xì)胞死亡的毒素誘導(dǎo)
2. 通過MCD飼料誘導(dǎo)的肝脂肪變性
3. 增強(qiáng)NASH的新一代膽堿缺乏飼料，沒有早期模型中觀察到的重度體重減輕
本文對(duì)比了這些傳統(tǒng)纖維化模型，探討它們?cè)诶w維化和NASH藥物開發(fā)方面的優(yōu)勢(shì)和局限性。
四氯化碳誘導(dǎo)NASH模型
溶劑四氯化碳（CCl4）是一種毒素，通過肝臟細(xì)胞色素P450代謝為三氯甲基自由基（–CCl3）。這會(huì)與許多肝臟靶標(biāo)發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到多種類似NASH的效應(yīng)：
- 線粒體活性氧簇引發(fā)的炎癥
- 脂代謝酶活性降低和高爾基氏體驅(qū)動(dòng)的VLDL分泌受損導(dǎo)致的脂肪變性
- 廣泛的細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和纖維化
這些有害效應(yīng)在沒有肥胖或胰島素抵抗的情況下發(fā)生，并且涉及大量與脂質(zhì)貯積和代謝無(wú)關(guān)的細(xì)胞死亡。因此，這并不能代表真實(shí)的NAFLD。
除了缺乏對(duì)人類NAFLD/NASH的真正可譯性外，該模型的主要缺點(diǎn)是影響非肝臟器官和組織的全身毒性，且由于CCI4對(duì)操作人員具有潛在化學(xué)危害，所以只能由訓(xùn)練有素的技術(shù)人員執(zhí)行，必須配備適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)設(shè)備和化學(xué)安全基礎(chǔ)設(shè)施。
MCD飼料誘導(dǎo)NASH模型
蛋氨酸和膽堿是肝線粒體β氧化和極低密度脂蛋白（VLDL）合成所需的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素。喂食MCD飼料時(shí)，甘油三酸酯的輸出受到抑制，從而迅速誘導(dǎo)肝脂肪變性和炎癥。
和CCl4一樣，MCD飼料因其易用性和快速誘導(dǎo)而廣受歡迎。兩周內(nèi)血清ALT/AST穩(wěn)健上升，并且臨床NAFLD活性評(píng)分在同一時(shí)間段內(nèi)接近最大值。纖維化也迅速發(fā)生，在短短4周內(nèi)就很明顯，10周內(nèi)達(dá)到重度。在不超過16周的過程中，纖維化是可逆的，因此應(yīng)在更長(zhǎng)的時(shí)間范圍內(nèi)運(yùn)行模型，以評(píng)價(jià)可改善NASH的藥物。但是，動(dòng)物選擇比CCl4模型受到更多限制，C57Bl/6小鼠是首選的易感小鼠品系；大鼠會(huì)進(jìn)展為穩(wěn)健的脂肪變性，但只有輕微炎癥，且沒有纖維化。
MCD模型有許多轉(zhuǎn)譯和實(shí)踐方面的缺點(diǎn)，最明顯的是，動(dòng)物經(jīng)歷了快速而嚴(yán)重的體重減輕（從喂食MCD飼料開始超過40%），以及血清葡萄糖、甘油三酸酯和膽固醇降低。體重減輕也造成操作人員在動(dòng)物處置和給藥方面的難度，而代謝表型則與人類狀況直接相反。
第二代膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)NASH模型
經(jīng)證明，第二代膽堿缺乏飼料可在嚙齒動(dòng)物中誘導(dǎo)NAFLD/NASH，而不會(huì)出現(xiàn)MCD飼料飼喂時(shí)的重度體重減輕。膽堿缺乏性氨基酸（CDAA）飲食可以用精確等量的左旋氨基酸代替蛋白質(zhì)含量，接受該飼料的C57Bl/6小鼠在3周內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性和炎癥，纖維化發(fā)生在第6周，并在第21周左右變?yōu)檩p度至中度，這也是可逆的。
這種飲食也適合Wistar大鼠誘導(dǎo)NAFLD/NASH，并且與小鼠的疾病發(fā)作和進(jìn)展時(shí)間范圍相近。盡管任何嚙齒動(dòng)物體重減輕都不是該模型的缺點(diǎn)，但是該模型中不存在NAFLD之前的人類代謝表型（胰島素抵抗、高血糖癥、脂血癥等）。
CDAA飼料的熱量脂肪含量從10-20％增加至60％（高脂膽堿缺乏飼料）會(huì)加速并加重NASH，并顯著降低纖維化的自發(fā)可逆性。在C57Bl/6小鼠中，該模型還將在24周內(nèi)發(fā)展為肝硬化、門靜脈高壓和肝功能衰竭，因此對(duì)于肝臟疾病研究項(xiàng)目而言具有多種用途。然而，在膽堿缺乏飲食的迭代中，沒有肥胖、高血糖癥和高甘油三酯血癥等代謝綜合征的特征。
結(jié)論
經(jīng)典的CCl4肝臟毒性模型以及膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的脂肪變性的多次迭代，為NASH和肝纖維化提供了一套特征明確且廣泛可用的嚙齒動(dòng)物模型。在選擇四氯化碳或膽堿缺乏飲食模型時(shí)，應(yīng)結(jié)合它們的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)考慮其在人體條件下可譯性方面的諸多局限性。
本文作者：中美冠科生物
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非酒精脂肪性肝炎已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)，然而NASH的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)其與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、瘦素、Kupffer細(xì)胞等多種因素相關(guān)。目前臨床上的藥物普遍存在毒副作用較大、價(jià)格昂貴等問題，而被證實(shí)的有效且無(wú)副作用治療方法僅有適當(dāng)?shù)臐u進(jìn)性減肥運(yùn)動(dòng)這一項(xiàng)。 因此探索新型無(wú)毒副作用藥物對(duì)其NASH臨床治療具有重要意義，而可靠的動(dòng)物模型對(duì)探索NASH的發(fā)病機(jī)制及防治發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。
目前國(guó)內(nèi)外的NASH模型主要包括3類：
① 營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型，它包括了高脂飲食脂肪肝動(dòng)物模型、高糖飲食脂肪肝動(dòng)物模型和蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）脂肪肝動(dòng)物模型。
② 復(fù)合因素誘導(dǎo)的NASH模型，主要是以高脂肪飼料加化學(xué)藥物來(lái)進(jìn)行造模，包括四氯化碳脂肪肝動(dòng)物模型、四環(huán)素脂肪肝動(dòng)物模型、乙硫氨酸脂肪肝動(dòng)物模型。
③ 特殊品系脂肪肝動(dòng)物模型，主要有瘦素缺乏和抵抗小鼠模型、PTEN基因敲除小鼠模型。其中，MCD飼料誘導(dǎo)的NASH模型是目前國(guó)際上被廣泛認(rèn)可的模型。
該模型最早由Shinozuka提出，起初是用于探討飲食因素對(duì)肝臟腫瘤形成的影響，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在短期內(nèi)可以引起脂肪性肝炎。該模型的脂肪性肝炎發(fā)展速度快，其病理病變與人類的NASH類似，因此成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究NASH的熱點(diǎn)模型，但未見關(guān)于在大小鼠體內(nèi)用MCD飼料誘導(dǎo)NASH模型差異比較的報(bào)道。
本研究旨在通過MCD飼料分別建立大、小鼠NASH模型，比較其生化和病理指標(biāo)，探討兩種動(dòng)物模型的差異，為NASH的基礎(chǔ)研究和防治藥物的開發(fā)提供可靠的動(dòng)物模型。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方案
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠18只，8~9周齡，體重為22~25 g；SPF級(jí)SD雄性大鼠18只，8~9周齡，體重為300~350g。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，屏障環(huán)境動(dòng)物房室溫（22 ±1）° ，相對(duì)濕度30%~60%，12h光照/12h黑暗，動(dòng)物自由采食和飲水。
實(shí)驗(yàn)試劑
檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）含量的試劑盒，均購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷公司，按說明書和文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行檢測(cè)。
動(dòng)物飼料
蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料和蛋氨酸膽堿充足（MCS）飼料，根據(jù)飼料生產(chǎn)公司技術(shù)人員的指導(dǎo)進(jìn)行飼養(yǎng)。
動(dòng)物分組
將18只C57BL/6小鼠和18只SD大鼠分別隨機(jī)分成正常組（飼喂MCS飼料）和模型組（飼喂MCD飼料）。模型組需要1周過渡性飼料的喂養(yǎng)，第1 ~3天將MCS和 MCD飼料按2:1混合后喂養(yǎng)，第4 ~5天按1:1混合喂養(yǎng)，第6-7天按1:2混合喂養(yǎng)，1周后完全投喂MCD飼料。過渡性飼養(yǎng)后的第3、5、8周在各組中分別隨機(jī)選取6只動(dòng)物樣本，進(jìn)行肝功能生化指標(biāo)和肝臟病理的檢測(cè)。從過渡飼喂開始且每周稱量動(dòng)物體質(zhì)量（g）并記錄。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
體質(zhì)量變化
正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量逐漸減輕；從第 3周開始，相比于正常組，模型組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量都顯著降低。
動(dòng)物血清中ALT、AST、TC和TG的含量
從第3周開始，模型組小鼠肝酶AST和ALT水平與正常組相比，均已顯著升高。相比之下，大鼠模型組在檢測(cè)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，肝酶AST水平無(wú)顯著變化，而ALT水平從第3周開始顯著升高。在檢測(cè)的造模后第3周、5周、8 周，大、小鼠血清中TG和TC含量均顯著降低。
肝組織HE染色
正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排 列,無(wú)肝細(xì)胞氣球樣變或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1A、C）。MCD飼料飼喂8周后，模型組的大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)已被破壞，大泡性氣球樣變細(xì)胞占了總細(xì)胞的2/3以上，以肝小葉周邊脂肪變性最為嚴(yán)重， 局部可見大泡性氣球樣變和以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主炎癥反應(yīng)（見圖1B）。8周時(shí)模型組小鼠肝組織光鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變 性，中央靜脈周圍出現(xiàn)嚴(yán)重、以浸潤(rùn)為主的局灶壞 死性炎癥（見圖1D）。具體NAFLD活動(dòng)度積分見表3，SD大鼠和C57BL/6小鼠綜合評(píng)分均表現(xiàn)為模型組與正常組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0. 05）。
實(shí)驗(yàn)討論
MCD飼料誘導(dǎo)的NASH模型的主要發(fā)病機(jī)制是由于飼料缺乏膽堿而引起機(jī)體卵磷脂合成不足。蛋氨酸為合成載脂蛋白所必需的氨基酸，缺乏 酸會(huì)導(dǎo)致低密度脂蛋白膽固醇合成減少，因此無(wú)法 將三酰甘油運(yùn)出肝外而累積形成脂肪肝。另一方面，缺乏膽堿還會(huì)引起肝臟線粒體內(nèi)部活性氧增加，最終導(dǎo)致氧應(yīng)激增加而肝臟發(fā)生損傷。氧應(yīng)激不但導(dǎo)致細(xì)胞多種功能和結(jié)構(gòu)損傷，而且活化TNFα及其他促炎癥細(xì)胞因子。
該模型自1978年Shinozuka提出以來(lái)，被國(guó)內(nèi)外的學(xué)者廣泛應(yīng)用于藥物篩選，但是缺少文獻(xiàn)對(duì)該模型在C57BL/6小鼠和SD大鼠的系統(tǒng)性報(bào)道。于是本實(shí)驗(yàn)飼喂MCD飼料建立大、小鼠NASH模型，對(duì)其血液的生化指標(biāo)和肝臟的病理指標(biāo)進(jìn)行了比較，旨在探討兩種動(dòng)物模型的生化和病理差異，以選擇理想的動(dòng)物模型。
本研究的結(jié)果顯示，在肝損傷指數(shù)方面，飼喂MCD飼料的第3周開始，模型組小鼠的肝酶AST、 ALT水平與正常組相比已經(jīng)顯著升高，但模型大鼠 AST水平從實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束仍無(wú)顯著差異，而AST和ALT的水平在臨床研究中通常作為肝臟功能評(píng)價(jià)重要指標(biāo)，反映脂肪肝的早期損害，因此表明C57BL/6小鼠對(duì)MCD飼料的反應(yīng)在早期比SD大鼠更敏感 ，更容易引起肝損傷肝 。
而且肝組織病理結(jié)果顯示，飼喂MCD飼料8周，模型組小鼠肝組織比大鼠出現(xiàn)的脂肪變性更嚴(yán)重，小區(qū)域出現(xiàn)小泡為主的細(xì)胞氣球樣變及輕微的炎癥反應(yīng)；同時(shí)通過肝組織病例評(píng)分結(jié)果表明8周后模型組小鼠肝組織炎癥反應(yīng)及脂肪變性等病理特征的得分明顯高于大鼠。另外，小鼠具有采食量少、成本低及操作方便等優(yōu)點(diǎn)。因此，綜合生化指標(biāo)及病理特征等因素，MCD飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠模型比SD大鼠模型更適用于進(jìn)一步研究NASH.
本文作者：崔國(guó)禎/余漢濠/黃天養(yǎng)/王文/徐義祥/程自剛/吳彩燕/李銘源，遵義醫(yī)學(xué)院
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